慢病毒Cas9表达系统使用说明.pdf

? ? ? ? 慢病毒 Cas9 表达系统使用说明? ? ? ? ? ? 本说明书用于：? ? 构建 Cas9 蛋白表达细胞系? ? 在 Cas9 蛋白表达细胞系中敲除目的基因? ? ? ? 适用于以下产品? 货号 货号 pLV‐Cas9 载体系列? CR2001，CR2002? pLV‐Cas9‐Nick 载体系列? CR2003，CR2004? pGR 载体系列? CR2011~CR2013? pGR‐EGFP 载体系列? CR2014~CR2016? ? ? ? ? ? ? ??????北京英茂盛业生物科技有限公司? ??????北京市昌平区沙河镇青年创业大厦 B‐916? ??????Tel：010 ??????Emai：order@? ??????Web?site：?? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????产品说明书? 目录 1、产品简介??2? 1.1CRISPR/gRNA 基因敲除原理??2? 1.2 慢病毒 Cas9 表达系统特点??2? 2、Cas9 表达慢病毒制备??3? 2.1 试剂准备??3? 2.2 简要实验流程??4? 2.3 实验前准备??4? 2.4 病毒制备步骤??5? 2.4?PEG 纯化慢病毒??6? 3、筛选 Cas9 表达稳定细胞株??7? 3.1? 试剂??7? 3.2? 实验前准备??7? 3.3? 筛选细胞系实验步骤??8? 3.4?Cas9 表达细胞系检测?9? 4、用 pTYNE 载体对 Cas9 表达细胞系进行验证??10? 4.1 验证 Cas9 蛋白表达细胞系??10? 4.2 验证 Cas9Nicknase 蛋白表达细胞系??11? 5、pGR 和 pGR‐EGFP 载体构建??13? 5.1?pGR 和 pGR‐EGFP 载体图谱??13? 5.2? 靶点设计??13? 5.3?pGR 载体构建步骤??14? 附录 1? 用到的产品??17? 附录 2? 引物列表??17? ? 1? 北京英茂盛业生物科技有限公司? ? Tel:?010 Email:?order@? ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????产品说明书? 1、 产品简介 1.1CRISPR/gRNA 基因敲除原理? CRISPR?(clustered,?regularly?interspaced,?short?palindromic?repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其 他外源 DNA 的免疫机制。在该机制中，Cas 蛋白（CRISP‐associated? protein）含有两个核酸酶结构域，可以 分别切割两条 DNA 链。一旦与 crRNA（CRISPR?RNA）和 tracrRNA 结合形成复合物，Cas 蛋白中的核酸酶即可 对与复合物结合的 DNA 进行切割。切割后 DNA 双链断裂从而使入侵的外源