DNA重組技术关明.pptxVIP

重组DNA技术;;;;一、重组DNA技术相关概念 ;技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）　;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;（二）工具酶;限制性核酸内切酶;作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发??的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;;影响限制性内切核酸酶活性的因素;DNA 分子的双酶切;DNA 分子的双酶切;两种限制性内切酶的体系兼容;两种限制性内切酶的体系不兼容;（三）目的基因;PCR 扩增获得目的基因;;（四）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;载体的选择标准;1. 质粒 (plasmid);当外源DNA 片段在BamHI、SalI或Pst I位点插入，可以用引起抗生素基因的失活来筛选重组体。;它有来自E.coli的Lac 操纵子的DNA 片段，编码?-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。IPTG可诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的缺陷型 ?-半乳糖苷酶实现基因内互补(?互补），在含有生色底物X-gal培养基上形成蓝色菌落。;λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;3. 粘性质粒(cosmid);酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;* 化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;;mRNA ;强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效地转录 在启动子下游区和ATG(起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD) 在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因转录和质粒的稳定性。;利用λ噬菌体 的PL、PR作为串联启动子，一个温度敏感的转录阻遏蛋白基因cI857位于上游，多克隆酶切位点与启动子之间 有SD序列，在MCS 下游区有一强的转录终止序列rrnBT1T2;融合蛋白表达载体Pmal-c4x.目的蛋白前面接有MBP(担体蛋白）。担体蛋白有二个作用：1使得蛋白更可溶，2使得纯合更方便。 The technique uses the strong Ptac promoter and the translation initiation signals of MBP to express large amounts of the fusion protein. The fusion protein is then purified by a one-step affinity purification specific for MBP .The system uses the pMAL vectors which are designed so that insertion interrupts a lacZα gene allowing a blue-to-white screen for inserts on X-gal?. The vectors include a sequence coding for the recognition site of a specific protease. This allows the protein of interest to be cleaved from MBP after puri