亲和层析法分离凝集素-new.pdf

亲和层析法分离亲和层析法分离 青豌豆凝集素青豌豆凝集素 原理原理 亲和层析亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，是利用生物大分子的生物学特异性， 即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力 而设计的层析技术。而设计的层析技术。 例如，酶－酶的抑制剂，抗原－抗体，酶蛋白例如，酶－酶的抑制剂，抗原－抗体，酶蛋白 －辅酶之间有－辅酶之间有专一专一的的可逆可逆的结合力（亲和力），的结合力（亲和力）， 在一定条件下能紧密结合成复合物，另一条件下在一定条件下能紧密结合成复合物，另一条件下 又可解离。如果将复合物的某一方固定在不溶性又可解离。如果将复合物的某一方固定在不溶性 载体上，则可以从溶液中专一性地分离和提纯另载体上，则可以从溶液中专一性地分离和提纯另 一方。一方。 程序程序 1. 选择被分离蛋白质的配体（选择被分离蛋白质的配体（关键关键），将配体以），将配体以 适当的形式连接到支持物上（如琼脂糖）。适当的形式连接到支持物上（如琼脂糖）。 2. 将支持物－配体络合物以适当的缓冲夜装在柱将支持物－配体络合物以适当的缓冲夜装在柱 中。中。 3. 蛋白质混合物上到柱顶部。大多数蛋白质径直蛋白质混合物上到柱顶部。大多数蛋白质径直 通过柱，能与配体相互作用的蛋白质被阻留或通过柱，能与配体相互作用的蛋白质被阻留或 被固定在柱上。被固定在柱上。 4. 洗柱，除去不需要的蛋白质。洗柱，除去不需要的蛋白质。 5. 用适当的方法将吸附在柱上的蛋白质洗下来。用适当的方法将吸附在柱上的蛋白质洗下来。 亲和层析 亲和层析的优点亲和层析的优点 1. 待分离物质与配基专一性结合，分辨率待分离物质与配基专一性结合，分辨率 高，操作简单，通过一次性操作即可得到高，操作简单，通过一次性操作即可得到 较高纯度的分离物质。较高纯度的分离物质。 2. 具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中 得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千 倍。倍。 3. 利用生物学的特异性进行分离，因而分离利用生物学的特异性进行分离，因而分离 条件比较温和，能够很好地保持样品原有条件比较温和，能够很好地保持样品原有 的生物学性质。的生物学性质。 亲和层析的种类亲和层析的种类 ? 凝集素亲和层析凝集素亲和层析 ? 免疫亲和层析免疫亲和层析 ? 金属螯合层析金属螯合层析 ? 染料配体层析染料配体层析 ? 共价层析共价层析 植物凝集素（植物凝集素（LectinLectin）） ? 一类特殊的蛋白，主要存在于植物中（豆一类特殊的蛋白，主要存在于植物中（豆 科植物）；科植物）； ? 对糖有很高的亲和性，含有两个或多个糖对糖有很高的亲和性，含有两个或多个糖 的结合位点；的结合位点； ? 可以使许多细胞发生凝聚（程度取决于凝可以使许多细胞发生凝聚（程度取决于凝 集素的浓度和细胞表面糖分子的多少之间集素的浓度和细胞表面糖分子的多少之间 的比例）。的比例）。 本实验的主要内容：本实验的主要内容： ? 利用亲和层析法纯化青豌豆凝集素；利用亲和层析法纯化青豌豆凝集素； ? 利用植物凝集素在体外能使红细胞发生凝利用植物凝集素在体外能使红细胞发生凝 集的特性来鉴定纯化的凝集素。集的特性来鉴定纯化的凝集素。 本实验中本实验中SephadexSephadex GG--5050的作用：的作用： 1.1. 载体载体 2.2. 配体配体 葡萄糖的作用：葡萄糖的作用： ? 与葡聚糖竞争结合凝集素，使凝集素被洗与葡聚糖竞争结合凝集素，使凝集素被洗 脱下来脱下来 操作步骤操作步骤 破碎细胞 离心 ↓ 4层纱布过滤 ↓ 离心 上样 ↓ ↓ 硫铵沉淀 洗脱 ↓ ↓ 离心 透析 ↓ ↓ 溶解 凝集实验 ↓ 装柱操作装柱操作 柱中加