2-DE流程永诺生物.doc

第2章 6张胶 1. 蛋白质样品的CyDye荧光标记 荧光标记使用CyDye DIGE Flour（minimal Dye）Labelling Kit进行，所有涉及Dye的操作在避光条件下进行。 取出－20℃保存的CyDye试剂盒，室温放置5~8分钟以防开盖时凝露，12000g离心1分钟； 按照试剂盒说明：每个原始包装管中各有5nmol的粉状Dye，加入5μl无水DMF后震荡30秒、12000g离心30秒，即成1nmol/μl的dye stock solution； 按照CyDye最小标记法原则，即400pmol的Dye可以标记50μg的蛋白，根据实验设计计算出所需各种Dye的总量（Cy2、Cy3、Cy5各需2.4nmol）； 以dye stock solution : 无水DMF＝2 : 3的比例，将dye stock solution稀释成working dye solution (400pmol/μl)，即working dye solution 2.4ul加入无水DMF 3.6μl，震荡30秒、12000g离心30秒； （注意：各种dye的stock solution和working solution未用完者必须密封后储存于－20℃，stock solution最多可保存两个月，working solution配制好后必须在两周内用完。）； 在每个准备进行??记的样品管中，根据实验设计加入1μl Cy3或Cy5的working dye solution，在pool管中加入6μl的Cy2 working dye solution，将所有样品管震荡30秒、12000g离心30秒； 荧光标记反应在冰浴、避光条件下进行30分钟； 在每个样品管中加入1μl Lysine solution，在pool管中加入6μl Lysine solution，震荡30秒、12000g离心30秒后，在冰浴中避光静置10分钟以终止标记反应； 按照实验设计，先将标记好的各个样品混合，然后在每个混合的样品中加入50μg Cy2标记的pool样品，震荡30秒、12000g离心30秒后－80℃冻存或直接进行双向电泳； 2.3.9 2-DE和2D-DIGE的第一向等电聚焦电泳（IEF）准备 IPG胶条的选择：根据先期预实验结果，本研究选择pH4~7，24cm的IPG胶条对样品的蛋白质进行等电聚焦分离； 准备各种用于不同检测手段的足量蛋白质样品： Deep purple染色：500μg/样品（按前述荧光标记准备中的pool样品） 2D-DIGE荧光检测：150μg/样品（Cy2、Cy3、Cy5标记的混合样品） 配制Rehydration buffer：每100ul的Rehydration stock buffer中加入DTT 2.8mg、IPG buffer（pH4-7）2.3μl、Bromophenol blue solution (1%) 0.92μl（用于2D-DIGE时IPG buffer用量为4.6μl）； 在每个样品管中加入Rehydration buffer 100μl； 使用Rehydration stock buffer将每个样品的体积补足至460μl，这样每460ul样品中就含有DTT 2.8mg、IPG buffer 0.5%（用于2D-DIGE时为1%）、Bromophenol blue 0.002%，达到进行IEF的要求； 所有样品管使用12000g离心8分钟以沉淀可能存在的不溶物，取450μl准备IEF上样。 2.3.10 第一向IEF（使用再水化上样法） 检查等电聚焦仪状况，准备洁净的胶条槽（IPG strip holder）以及胶条覆盖液（IPG strip cover fluid）； 将上述制备的含蛋白质样品的450μl Rehydration buffer均匀的涂布在胶条槽两电极之间，避免产生间断和气泡； 取出－20℃保存的IPG干胶条（IPG strip pH4-7），使用镊子从正极（酸性端）开始小心的撕掉保护膜，将IPG胶条的胶面向下，并将其正极端顶至胶条槽正极端，缓缓的把整个胶条放入胶条槽中，检查样品溶液在胶下是否均匀及有无气泡； 每个IPG胶条上均匀覆盖1ml左右的IPG strip cover fluid以防电泳时水分蒸发； 盖上胶条槽盖，再次检查上样情况，并核对样品与相应的IPG胶条编号，（对荧光标记样品的IEF需要加避光罩进行）； IEF程序设置： Current: 50μA/strip Step 1: 30V, 12h, step-n-hold Step 2: 500V, 1h, step-n-hold Step 3: 1000V, 1h, step