2012级121221研究生免疫学实验指导.doc

PAGE  PAGE 10 2012级研究生免疫学实验指导 东南大学医学院 病原生物学与免疫学系 目的：掌握常见的免疫功能测定方法。 内容：一、NK细胞杀伤活性检测（鼠脾细胞） 二、外周血中淋巴细胞的分离和T细胞检测（人PBMC） 三、直接免疫荧光法测定T细胞亚群（鼠脾细胞） 四、ELISA测定特异性抗体（人血清） 概述: 免疫功能是机体重要的生理功能，机体通过免疫系统可以识别和排除抗原性异物，维持机体内环境的稳定，免疫功能可分为天然免疫和获得性免疫。 天然免疫(innate immunity)是机体在种系发育和进化过程中形成的防御功能，它由屏障结构、免疫细胞(单核-巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞等)和体液中抗微生物的分子(补体、溶菌酶、干扰素等)构成，它们是机体的第一道防线，在抵抗病原体的侵入和感染早期中执行防卫功能。 获得性免疫(acquired/adaptive immunity)是指出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能，具有特异性和记忆性，又称为特异性免疫。特异性免疫可分为体液免疫和细胞免疫，其中体液免疫的效应产物为抗体，抗体在清除细胞外的病原菌及其产生的毒素等抗原方面发挥重要作用；而细胞免疫的效应产物为效应T细胞(CD8+CTL和CD4+Th1细胞)，效应T细胞在清除胞内的病原体感染，排斥异体移植物及抗肿瘤免疫中起重要的作用。 通过检测免疫功能, 不仅可以了解机体的正常免疫功能状态，而且可以研究实验条件下和病理状态的免疫功能变化及其各种影响免疫功能的因素，目前免疫功能的检测方法已广泛应用于医学和生物学领域的研究。 实验课流程安排 第一天8：00开始，上午和下午 NK实验和人外周血中PBMC分离及E-花环实验同时进行 1份/组，5人/组 1.每组安排3名同学做NK实验，每个实验室分有2个超净台，每次2个小组进行实验，轮流进行；另外每组安排2名同学做PBMC分离及E花环。 2.每个组取1只小鼠，选2人在超净台中（无菌环境下）杀鼠取脾细胞，计数后将细胞用1640细胞培养液调整脾细胞浓度为2.5×106脾细胞/ml,每组需2 ml细胞悬液，加入1支无菌试管中备用，进行NK实验。 3.每个实验室邀1名同学采血5ml,加入5 ml Hanks液混匀，而后每组分得2ml抗凝血自行进行PBMC分离和随后的E-花环实验。 4.下午试验结束前包被酶标条板，为第二天的ELISA实验做准备。 第二天8:00开始，上午 T细胞亚群荧光染色和ELISA实验同时进行，1份/组，5人/组 1.每室取1只小鼠，选2人在实验室中（有菌环境下）杀鼠取脾细胞，计数后将细胞分至每个小组：用0.5％BSA－PBS调整细胞浓度为5×106脾细胞/ml,每组得2 ml，分别加入2支玻璃小试管中（1ml/管），离心后弃上清，细胞沉淀分别进行CD4和CD8荧光染色。 2. 每组选部分同学进行酶联免疫吸附实验 实验一 NK细胞杀肿瘤细胞活性检测 原理： NK细胞是天然免疫反应中的一类主要的效应细胞，对机体的靶细胞（如肿瘤细胞、病毒感染细胞等）进行非特异性杀伤，作用机制包括分泌穿孔素、颗粒酶等。NK细胞杀伤活性的检测和分析能充分反应机体的天然细胞免疫功能状态，有助于了解疾病进程和治疗效果等方面的情况。本实验取未免疫鼠的脾细胞群作为NK细胞的来源，使之与Yac-1肿瘤细胞共孵育。后者是小鼠NK细胞最敏感的靶细胞。MTT(甲臢)能参入活细胞的胞浆中，当细胞被杀破裂后，MTT从胞浆中释放出来，可离心去除。剩余活细胞被DMSO破坏后MTT被溶解显色，颜色的深浅在一定范围内与活细胞的数量呈正比。MTT掺入法是区分死活细胞的常用方法之一。 主要试剂： 1.小鼠脾细胞：来源于昆明鼠，每组1只小鼠。 2.Yac-1肿瘤细胞株：1×105/ml，2ml/组 3.10%FCS-1640细胞培养液 4．无菌Hanks平衡盐溶液 5.无菌细胞离心管 6.无菌吸管和滴管 7.MTT (5mg/ml in 1640 medium，2.5ml/室) 8.DMSO 原液（200 ml/室） 9. 96孔U形底细胞培养板 10.血球计数器、96孔板离心机、酶标仪、显微镜等 分组：5人/组 操作步骤：（在超净台中进行） 脾细胞悬液的制备：将已采取血液的小鼠进行颈椎脱位，处死的小鼠置70%乙醇中浸泡5-7 min，采取小鼠脾脏置于含有Hank’s液的平皿中，金属网上研压，收集小鼠脾细胞悬液于一无菌离心管中。 脾细胞的洗涤：加入Hank’s使脾细胞悬液至6mL，离心1200r/min、12min，一次性弃上清，弹起细胞沉淀后再加入Hanks液至6mL，混匀后进行细胞计数。离心1200r/min，12min