Western实验操作程序.doc

Western blot 实验操作程序 一、储存液的配制： 1. )1.5M Tris-HCl（PH8.8）：100ml Tris 18.15g 去离子水 50 ml 缓慢加浓盐酸调PH至8.8（约4 ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml. 2.) 0.5M Tris-HCl（PH6.8）：100ml Tris 6.05g 去离子水 50 ml 缓慢加浓盐酸调PH至6.8（约8ml），冷却至室温后再加去离子水至100 ml.. 3. )10%SDS（W/V）：100ml SDS 10g 去离子水 100 ml 溶解后，室温下保存。 4.)50%（v/v）甘油：100ml 100%甘油 50 ml 去离子水 50 ml 混匀后，室温下保存。 5. )1%溴酚蓝：10 ml 溴酚蓝 100mg 去离子水 10ml 搅拌至完全溶解，经过滤后使用 6. )丽春红S(Ponceau S)储存液：100 ml 丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 去离子水 100ml 混匀后，室温下保存。 7. )10×转膜液：1000 ml 甘氨酸 90g Tris 19.3g 加去离子水至1000 ml，PH在8.3-8.4左右. 二、工作液的配制： 1. 组织（或细胞）裂解液：3 ml 或 5 ml 试剂初始浓度终浓度3 ml5 mlNaCl 1 mol/L0.1 mol/L300μl500μlTris-HCl1mol/L0.01mol/L 30μl50μlEDTA0.5mol/L0.001mol/L 6μl 10μlAprotinin1mg/ml 0.001mg/ml3μl 5μlPMSF 10mg/ml0.01mg/ml30μl50μlTritonX-100 3%1%1 ml1.6ml去离子水1.64ml2.8ml PMSF（苯甲基磺酰氟）：可抑制蛋白酶的降解作用，有较强的毒性，可严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，使用时需戴手套操作。它在水溶液中不稳定，使用时需新鲜配制（可先配成10 mg/ml的储存液，需用异丙醇溶解）。 Aprotinin（抑肽酶）：可抑制组织裂解后释放出的蛋白酶对蛋白质的降解作用。 2. 5×变性loading:10 ml 1M Tris-HCl（PH6.8）0.6 ml60mM50%甘油5ml 25%10%SDS2ml2%1%溴酚蓝1 ml0.1%去离子水0.9ml混匀，在4oC下可保存数月。 3. 丙烯酰胺储存液（30%）：100 ml 丙烯酰胺 29 g 双丙烯酰胺 1g 去离子水 100 ml 丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体均具有强神经毒性，其作用具有累加性，配制时必须戴手套，防止皮肤接触。 搅拌至完全溶解，在4oC下可保存数月。 4. 4?分离胶缓冲液：100 ml 2M Tris-HCl（PH6.8） 75 ml 1.5M 10%SDS 4ml 0.4% 去离子水 21ml 混匀后可在4oC下保存数月，配分离胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4?的缓冲液即可 5. 4?堆积胶缓冲液: 100 ml 1M Tris-HCl（PH6.8） 50 ml 0.5M 10%SDS 4ml 0.4% 去离子水 46ml 混匀后可在40C保存数月，配堆积胶时使用，注意用时不需再稀释,直接用4?的缓冲液即可 6. 10%过硫酸胺(APS)：5 ml 过硫酸胺 0.5g 去离子水 5ml 分装后，保存于-200C 7. 电泳缓冲液:1000 ml Tris 3g 25 mM 甘氨酸 14.4g 192 mM SDS 1g 0.1% 加去离子水至1000 ml，PH在8.