HPLC法测定肿节风提取物中反丁烯二酸的方法及优化2.pdfVIP

HPLC法测定肿节风提取物中反丁烯二酸的方法及优化① 摘要 目的 探索及优化HPLC法测定肿节风提取物中反丁烯二酸的方法。方法 采用单因素试验分别对HPLC法测定肿节风提取物中反丁烯二酸的流 动相比例、流动相PH值、流速、柱温进行优化，每个因素设定4个水 平，以找出每个因素的最适宜水平。结果 在乙腈- 磷酸V:V=15:85、磷酸PH=3、流速为1ml/min，柱温28℃条件下，对 对照品与供试品进行色谱分离结果较满意。结论 经单因素实验优化实验条件可以用于测定肿节风中反丁烯二酸含量 。 关键词：肿节风 反丁烯二酸 高效液相色谱法 单因素试验 肿节风为近年研究较多的中草药，又名草珊瑚、九节茶、接骨 金粟兰等，为金粟兰科植物草珊瑚Sarrandra gLabra (Thμnb.) Nakai的干燥全草。肿节风味苦，辛，性平，具有清热凉血，活血消 斑，祛风通络的功效[1]。现代医学研究表明肿节风的化学成分主要 有：有机酸、黄酮、倍半萜、挥发油、香豆素等多种化学成分，具 有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒等多种活性[2- 3]。本实验通过高效液相色谱法测定肿节风药材中反丁烯二酸的含量 ，以期获得一个专属性高、准确性好、简便的测定方法，为进一步 研究肿节风中的有效成分提供依据。 1 仪器与试药 高效液相色谱仪：戴安Μ- 3000高效液相色谱仪，紫外可变检测器（Μ3000），变色龙6.8工作 站、色谱柱：AccLaim C18（250nm×4.6nm，5μm）、电子分析天平、水浴锅、超纯水仪、 负压过滤器、超声波清洗器、中药粉碎机。对照品反丁烯二酸（批 号：111541- 201102，中国食品药品检定研究院）、肿节风药材（购于百色市生 物医药有限公司，产地：玉林）经本院张树球教授鉴定为肿节风药 材。磷酸为分析纯、乙腈为色谱纯，超纯水。 2 方法与结果 2.1 对照品和供试品的制备 精密称取反丁烯二酸对照品8mg，置于100ml容量瓶中，加乙腈溶解 并稀释至刻度，摇匀，0.45μm有机微孔滤膜过滤即可。 精密称定肿节风药材茎粉末1.0g，置100ml锥形瓶中，加???约50m l甲醇，于70℃水浴回流提取1h，将提取液于60℃水浴挥干，残渣用 乙腈（原液与乙腈体积比为4:1）超声10min溶解，0.45μm有机滤膜 过滤，即为供试品。 2.2 对照品检测波长的选择 取对照品溶液，在流动相为乙腈- 0.1%磷酸溶液（20:80），流速1ml/min，柱温30℃、进样量为20μl 的条件下，进行3D紫外扫描，反丁烯二酸在220nm有最大吸收峰，选 择220nm作为检测波长。 2.3 单因素试验 以流动相的配比、流动相PH值、流速、柱温作为影响色谱分离效果 的单因素，分别对反丁烯二酸标准品进行色谱分离，以找出不同因 素的适宜范围。 2.3.1 流动相的配比对色谱分离的影响 在柱温为28℃、检测波长为220nm、流动相磷酸PH2.9、流速为1ml/m in，进样量为20μl的条件下，以乙腈：磷酸体积比分别为：V:V=25 :75、20:80、15:85、13:87条件下，分别进样色谱分离。结果以乙 腈-磷酸V:V=15:85色谱分离效果较佳。 2.3.2 流动相PH值对色谱分离的影响 在柱温为28℃、检测波长为220nm、乙腈- 磷酸V:V=15:85、流速为1ml/min，进样量为20μl的条件下，以磷酸 PH 2.9、3、3.5、4条件下，分别进样色谱分离。结果以磷酸PH=3色谱 分离效果较佳。 2.3.3 流速对色谱分离的影响 在柱温为28℃、检测波长为220nm、乙腈- 磷酸V:V=15:85、磷酸PH=3，进样量为20μl的条件下，以流速为0.8 、0.9、1、1.5ml/min条件下，分别进样色谱分离。结果以流速为1m l/min色谱分离效果较佳。 2.3.4 柱温对色谱分离的影响 在检测波长为220nm、乙腈- 磷酸V:V=15:85、磷酸PH=3、流速为1ml/min，进样量为20μl的条件 下，以柱温为26、28、30、35℃条件下，分别进样色谱分离。结果 以柱温28℃色谱分离效果较佳。 2.4 对照品及样品测定结果 在检测波长为220nm、乙腈- 磷酸V:V=15:85、磷酸PH=3、流速为1ml/min，柱温28℃，进样量为2 0μl的条件下，分别进样色谱分离，结果见下图1.