核酸杂交技术 分子生物学.pptx

Nucleic Acid Hybridization;主 要 内 容;一、核酸分子杂交的概念及原理; 核酸经加热变性后，在低于变性温度20℃-30℃时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核酸片段。 ;;1. 核酸探针的分类;根据探针中核酸的性质分：;(1)DNA探针（包括cDNA探针）的优点：;(2)RNA探针：主要是细胞mRNA和病毒RNA探针。; 采用化学合成的短链寡核苷酸探针, 最常用的寡核苷酸探针有18-40个碱基。;2. 探针设计的条件;3. 核酸探针的常用标记方法; 切口平移法（nick translation）;由DNaseⅠ和大肠 杆菌DNA聚合酶Ⅰ 共同完成。;随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46 = 4096; 产物平均长度为400-600个核苷酸。 Klenow片段没有5 ’ →3’外切酶活性, 反应稳定, 可以获得大量的有效探针。 反应时对模板的要求不严格, 用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。;(3)末端标记法;乙醇沉淀法 凝胶过滤法（G-50 Spin column）;非放射性探针的标记; 以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP, Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入新合成的DNA。可以采用切口平移法和随机引物延伸法进行。 ; 光敏生物素分子侧链上连接的芳香基叠氮化合物具光敏感性，在一定波长的光照射下，光敏基团可活化为芳香基硝基苯，很易与腺嘌呤N7 位氨基特异结合，形成生物素化的核酸探针。;酶标法;酶标法;酶标法; 地高辛（ Digoxigenin，DIG）即异羟基洋地黄毒甙，是一种类固醇半抗原，来源于植物（Digitalis purouren 和Digitalis lanta）的花和叶中。 DIG 可以与dUTP反应形成DIG-dUTP，通过酶促法插入到合成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。;;三、核酸分子杂交的类型 ; 概念：;分类：;常用杂交方法介绍;基本原理： 是1975年由英国人Southern创建，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离，然后将DNA从凝胶中转印至滤膜上与探针杂交。 通过检测与探针互补DNA条带来确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。;提取DNA;;2、限制性核酸内切酶切断DNA;3、琼脂糖凝胶电泳和碱变性;4、将DNA转移至尼龙膜;;;真空转移法;5．膜的洗涤、固定;6.探针标记和预杂交 ;;（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带固定，合上暗盒。（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。; Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 ;基本原理：将RNA标本经琼脂糖凝胶电泳分离后转印至硝酸纤维素膜上，烘干固定后于探针杂交。; RNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光;四、核酸分子杂交实验因素的优化;根据不同的杂交实验要求，选择不同的探针：; 视个人的习惯和可利用条件而定，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。;3. 探针的浓度;4. 杂交温度;最适复性温度： Tor = Tm –25℃ 苛刻复性温度： Ts = Tm – (10或15℃) 非苛刻复性温度： Tns = Tm – (30或35℃) ;5. 杂交反应时间;常用促进剂：;（三）、DNA芯片（DNA chip）; 基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列（Microarray）技术将高密度DNA片段通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。;基因芯片工作流程;（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip） 特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析； 寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。;基本原理;（3）研究范畴