16S rDNA方法鉴定细菌种属1.doc

16S rDNA方法鉴定细菌种属 一．目的 1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法； 2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。 二、原理 随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。 细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。　 在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。 1、16S rRNA 普遍存在于原核生物中。rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。 　　2、在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。 　　3、16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1 540 个核苷酸，便于序列分析。 4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 利用16S rDNA鉴定细菌的技术路线： 三、操作步骤 （一）细菌基因组DNA提取 1. 挑单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。 2. 取2 mL培养液到2 mLEppendorf管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。 3. 加140 μLTE打散细菌，再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。 4. 加入400 μL Digestion Buffer，混匀。再加入3 μL Protein K，混匀，55℃温育5分钟。 5. 加入260 μL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。 6. 加入500 μL 70％乙醇（Wash Solution），10000 rpm离心0.5分钟。 7. 重复第六步。 8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5 mL的离心管。 9. 加入50 μL预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。 10. 电泳。取3 μL溶液电泳检测质量。 （二）PCR扩增 1. 根据已发表的16S rDNA序列设计保守的扩增引物。 16S (F) 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 16S (R) 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 2. PCR扩增体系： 在0.2 mL Eppendorf管中加入1μL DNA，再加入以下反应混合液： 16S (F) 1μL (10μM) 16S (R) 1μL (10μM) 10×PCR Buffer 5 μL dNTP 4 μL Taq酶 0.5 μL 加ddH2O使反应体系调至50 μL，简单离心混匀。 3. PCR反应 将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为： 94℃ 3 min 94℃ 30 s