乳酸菌的耐药检测方案.doc

试验方案： 一、样品的取样 在青岛胶州市的正规超市购买5种酸奶，进行实验时均处于产品保质期内。对这几种样品分别进行取样。 二、样品的稀释 在无菌工作台上用灭菌过的移液管直接从酸奶样品中吸取1mL装入9ml无菌生理盐水试管中，快速震荡试管，，使其呈1:10的均匀稀释液，同法继续稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度，选取合适的三个稀释度（如：10-1、10-2、10-3）按此操作依次制备成A1-A2-A3、B1-B2-B3、C1-C2-C3、D1-D2-D3、E1-E2-E3的样品稀释液。 三、样品的分离鉴定 1、分别用移液枪吸取A-E的样品稀释液250μL置于MRS固体培养基（MRS培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4?2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80?1mL，MgSO4·7H2O?0.58g，MnSO4·4H2O?0.25g，（琼脂15～20g），蒸馏水1000mL）平板上，涂布均匀后置于37℃培养箱培养24h，观察培养结果及细菌的生长情况。用接种环在各平板上挑取出现不同菌落形态大小的单一黄色菌落，分别在平板上划线，37℃倒置培养24h。 2、根据菌落的大小、颜色、光泽和透明程度等，从培养24h的每个平板中选取单菌落，在MRS固体平板上反复划线纯化，反复进行此操作步骤以使最终培养出的每个菌落都为单一菌种菌落，37℃培养24h。然后依次进行菌体形态观察、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、明胶液化试验、乙酰甲基甲醇试验、产气试验、碳水化合物发酵试验、乳酸定性检测。 （1）菌体形态的观察 将划线平板上培养了24h的各菌株在载玻片上涂片及固定后，进行革兰氏染色。先用草酸铵结晶紫初染色，1分钟后水洗载玻片，然后碘液媒染1分钟，水洗、吸干。95%乙醇脱色直到滴加的酒精不出现紫色，接着水洗、吸干。最后用0.5%的番红染色液再染色10-30秒，水洗，干燥，置于光学显微镜下观察其形态特点及染色结果。选取油镜观察细胞呈杆状或球状，革兰氏阳性菌。 （2）过氧化氢酶测定实验 取一环接种的培养物，涂于干净的载玻片上，然后在其上滴加过氧化氢，有气泡则为阳性反应，无气泡为阴性反应。 （3）淀粉水解试验 将固体淀粉培养基融化后冷却至50℃左右，无菌操作制成5个平板，将划线平板上培养了24h的各菌株分别在不同平板上划线接种。将平板倒置37℃恒温箱中培养24h。观察各种菌的生长状况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。 如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生细胞外淀粉酶活力的高低。 需要的试剂：H2SO4、HCl、MRS固体培养基（蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4?2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80?1mL，MgSO4?7H2O?0.58g，MnSO4?4H2O?0.25g，（琼脂15～20g），蒸馏水1000mL） 卢戈氏碘液（碘 5g 碘化钾 10g 蒸馏水 加至100ml） 需要的仪器：恒温箱 （4）明胶液化试验 将被检菌穿刺接种于明胶培养基，于22℃培养7d，逐日观察结果。若用35℃孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置4℃冰箱内30min，再看结果。 结果：培养基呈液化状态为阳性。 需要的试剂：明胶培养基（NaCl5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，明胶120g，蒸馏水1000mL 在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后调pH 7.2~7.4， 121°C 灭菌30min。） 需要的仪器：电磁炉 恒温箱 （5）乙酰甲基甲醇试验 用接种针将划线平板上培养了24h的各菌株分别穿刺接入5支葡萄糖蛋白胨水培养基中，置37℃培养58h。在试管培养液中直接加入10~20滴的40%KOH和5%α-萘酚乙醇溶液，用力振荡。 结果：如果出现红色，则为阳性；若仍呈黄色，则为阴性。 需要的试剂：蛋白胨水培养基（氯化钠0．5克，蛋白胨1克，水加至100ml）40%KOH 5%α-萘酚乙醇溶液） 需要的仪器：电磁炉 恒温箱 （6）产气试验 用记号笔在各支试管外壁上分别标明发酵培养基的名称，取乳糖发酵培养基6支，分别接入划线平板上培养了24h的各菌株，第六支不接种，作为对照。接种后，轻轻摇动试管使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。将接种过的6支试管均置于37℃培养基中培养24～48h。观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 结果：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性。表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示：如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳