2-酶譜法檢测血清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性.ppt

蛋白质高级结构的预测 酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性 食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性变化及其临床意义; ;第一部分，蛋白质高级结构的预测;截至2008年6月，与迅速增长的庞大基因组核酸数据相反，已知三级结构的蛋白数量还不到6万个。（来自蛋白结构数据PDB的统计）;利用蛋白质的一级结构所提供的氨基酸序列信息来进行高级结构预测的方法就是应这种需要而发展起来的。 蛋白质的一级结构决定高级结构这一论点，仍然是进行蛋白质三级结构预测的理论基础。 目前蛋白质三级结构预测的方法有： （1）在已知结构（如晶体结构）的基础上利用分子动力学方法研究蛋白质分子、 核酸分子或复合物的动态性质。 （2）利用能量优化或分子动力学方法对结构模型进行优化；或者是在整体结构已知的情况下建立点突变体的结构。 （3）借助于类似物的结构参数建立未知蛋白质的结构。 （4）结合2D-NMR数据或X-RAY粗结构数据或其他的实验数据建立蛋白质的整体模型结构模型。;（5）在上述条件均不符合的情况下，根据一级结构进行二级结构预测，准确度＜65％。（6）在已知二级结构的基础上进行片段堆积，根据从已知结构得出的一些规则进行筛选，挑选可能的结构，往往得到多种可能性，尚不能得到唯一的正确堆积方式。（7）在单体结构已知的情况下，建立复合物或多聚体的结构，参考复合物或聚合物本 身的性质，利用几何匹配和最大接触面积规则进行。;从待测蛋白质序列出发，有哪些信誉好的足球投注网站蛋白质结构数据库（如PDB,SWISS-PROT等），得到许多相似序列（同源序列），选定其中一个（或几个）作为待测蛋白质序列的模板； 待测蛋白质序列与选定的模板进行再次比对，插入各种可能的空位使两者的保守位置尽量对齐； 建模：调整待测蛋白序列中主链各个原子的位置，产生与模板相同或相似的空间结构，待测蛋白质空间结构模型； 利用能量最小化原理，使待测蛋白质侧链基团处于能量最小的位置。;SWISS-MODEL 蛋白质结构预测 ;First Approach mode(简捷模式） 这种模式提供一个简捷的用户介面：用户只需要输入一条氨基酸序列，服务器就会自动选择合适的模板。如果一条模板与提交的目标序列相似度大于25%，建模程序就会自动开始运行，结果以Email形式返回。;常用观看蛋白三级结构的软件;第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性;常见电泳技术;电泳设备;水平电泳系统;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 对pH和温度变化较稳定； 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。;SDS－PAGE的原理;不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图;不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系;肿瘤细胞的侵袭移动;细胞间基质结构示意图;肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。 虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。 肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金属蛋白酶(metalproteinase, MMP)类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。 ;MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨基酸序列的同源性分为三大类： （1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原； （2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底