1.2基因工基程本操作程序.ppt

基因工程的基本操作程序;启动子; 二、真核细胞的基因结构;三、基因工程的操作过程;1、什么叫目的基因： 主要指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因， 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、 种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。 ; ①.从基因文库中获取目的基因 ②. 利用PCR技术扩增目的基因 ; 从基因文库中获取目的基因;寻根问底 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？ 提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。;2、基因文库的分类 ;3、; 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?;4.基因文库的构建方法;　用限制酶切断成许多片段;鸟枪法：;⑵人工合成基因法;反转录法的过程： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。;⑶根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：;上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？;提问：你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？;.如何从基因文库中找到所需要的基因？ 从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。 第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。 ; 第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。 第三步，按Southern (DNA与DNA分子)杂交的方法进行杂交。 第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。 第五步，从该菌落中再提取目的基因。 ; 利用PCR技术扩增目的基因 ;① 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术 ;⑥过程：; 解释： PCR的扩增过程是怎样的？ PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。 第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95 ℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。 第二步：将反应体系降温至55～60 ℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。 第三步：将反应体系升温至70～75 ℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。;;;看p11 第二步、基因表达载体的构建：; 目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。;第二步、.基因表达载体的构建：;位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录mRNA，最终获得蛋白质;位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录; 基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？ 道理何在？ 主要考虑以下几方面的因素。 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能