荧光定量PCR原理和应用-LQ范例.ppt

实时荧光定量PCR原理及应用;实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。 实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。;实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的方法应用 实时荧光定量PCR的实验要素及 注意事项;实时荧光定量PCR原理 ;三步循环：高温变性，低温退火，中温延伸;;反应体系中加入荧光物质 荧光强度随着PCR扩增产物的积累成比例变化 通过检测荧光信号对PCR反应进行实时定量监测;与普通PCR的区别;为何使用实时荧光定量PCR对起始模板定量;实时荧光定量PCR如何对起始模板定量？ 引入两个概念： 荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长的初期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准) 循环阈值 (Ct值)：PCR扩增过程中，扩增产物量(荧光强度）到达阈值时所经过的循环次数;;公式推导:;;设立标准曲线： 设定阈值线，得到每条扩增曲线的Ct值，软件自动利用标准品的起始浓度和Ct值作出标准曲线。 ;通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度;什么是实时荧光定量PCR 荧光检测原理 ;荧光染料类 SYBR Green I 荧光探针类 Molecular Beacon （分子信标） TaqMan;SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料结合到双链DNA后荧光信号增强1000倍。;使用方便 --- 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 --- 可以用于不同的模板 便宜 灵敏;对引物特异性要求较高 与非特异性产物结合， 因此必须在反应结束后 做熔解曲线分析;熔解曲线分析 通过产物的Tm值来确定产物 ---可区分单一产物、变异产物、多种产物、引物二聚体 ;Molecular  Beacons;原理：荧光谐振能量传递（FRET） ; 荧光淬灭:不发光 展开:发出荧光;环形结构与目的片断结合比茎部自身的相互配对更稳定;对目标序列有很高的特异性 ——SNP检测最灵敏试剂之一 荧光背景低 ;设计困难 既要避免产生强的背景信号，又要避免茎部杂交过强，影响其与模板的退火，从而影响荧光的生成 只能用于一个特定的目标 价格较高;TaqMan 探针;目标特异性探针 5’ 为荧光基团， 3’ 为淬灭基团;R;对目标序列有很高的特异性 ---特别适合于SNP检测 与 Molecular Beacons 相比引物设计 相对简单 可以在一个反应中进行多个基因的定量 重复性比较好;价格较高 只适合于一个特定的目标 背景高 ;化学试剂;OUTLINE;实时荧光定量PCR应用;内源基因拷贝数的鉴定 转基因拷贝数的检测;绝对定量与相对定量 ;绝对定量 ——通过标准样品定量 ;;相对定量的目的 比较靶序列在不同样本中的量的差异（倍数关系） 如何实现准确的相对定量？ ---解决模板提取过程中造成的差别 ---解决加样过程中的差别 如何保证不同样品（RNA或DNA）上样量的一致?;在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小 内标数量代表样本中所含细胞或基因组数量 对样品量校正：目的基因数量/内标基因 内标通常选用beta-actin、GAPDH基因、18s rRNA 等看家基因;2-ΔΔc(t) 法 双标准曲线法 ;2-ΔΔc(t) 法;理想PCR反应 每增加一个循环 产物增加一倍 N个循环2n倍;;适用范围;问题与解决;问题与解决;双标准曲线法;适用范围;利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异-双标准曲线法;组分;;标准曲线;样品扩增：正常vs肿瘤;实验结果;Healthy RNA;2-ΔΔc(t) 法;定性分析：;F;两条探针分别针对不同等位基因;;实验2;;;熔解曲线分析;Identical reaction components, except initial template concentration varies;10,000 copies