6_第六章__基因的转移与重组体的筛选和鉴定教程.ppt

第六章　基因的转移与重组体的　　　　筛选和鉴定 ;一、粘性末端的连接;（一） 直接连接;（1）同聚加尾法 ;④缺点：;（2）衔接物（linker）连接;（1）多核苷酸激酶处理;（二） 人工加尾形成 “粘性末端” ;接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接;Blunt-ended DNA;三、PCR产物的连接;三、PCR产物的连接;带酶切位点的PCR产物;A;三、Gateway 载体构建系统;三、Gateway 载体构建系统;三、Gateway 载体构建系统;第二节 重组体导入受体细胞;（一）转化（transformation）;制备感受态细胞;制备感受态细胞;10ng 载体DNA;（2）电转化法;（二） 转　导; 体外包装过程 ;二、重组DNA导入真核细胞;1. 利用原生质体进行转化 ; 酵母;4. 电击转化;二、重组DNA导入真核细胞;（二）导入植物细胞;（二）导入植物细胞;（二）导入植物细胞;（二）导入植物细胞;在饲养平皿的滤纸上培养2天;又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。;;具体操作 ;植物细胞;二、重组DNA导入真核细胞;原理：;;操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。;2. 脂质体介导法;;应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。;;二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。;DEAE-dextran;;三、转化率及影响因素;三、转化率及影响因素;三、转化率及影响因素;三、转化率及影响因素;1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度 2）受体细胞 3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率;一、载体表型选择法 二、根据插入基因的表型选择 三、DNA电泳检测法 四、PCR检测法 五、核酸杂交检测法 六、免疫化学检测法 七、DNA序列分析;1. 抗药性标记及其插入失活选择法;2. ?-半乳糖苷酶显色反应选择法;;利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。;例：抗生素抗性;有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。;2. 酶切电泳筛选法;;四、PCR扩增检测法;五、核酸杂交检测法 ;2. Northern blotting;3. Western blotting;膜;4. 原位杂交筛选;利用抗体作为“探针”，检测产生外源DNA编码的抗??的菌落或噬菌斑。;DNA测序是最为准确的重组子鉴定方法，可以鉴定重组克隆序列是否准确无误。;（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （Luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。;（1）获得目的基因； （2）目的基因与载体的酶切与连接； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）转化受体细胞的大量繁殖； （5）目的基因的检测和表达。;1、什么是感受态细胞？简述CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理 ？ 2、什么是Ti质粒？简述农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法。 3、重组子筛选主要有哪些方法 ？