浙江大学生物化学甲实验课件实验9氨基移换反应和其产物的鉴定.ppt

实验九;一、实验目的和要求 1、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理； 2、学习纸层析的原理和操作技术。;GPT催化下的转氨基反应为：;; 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示： ; ;三、实验材料与试剂 1、实验材料 动物肝脏(牛蛙肝或猪肝） 2、实验试剂 ⑴ 0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）（转氨基反应所需缓冲溶液）； ⑵ 0.1mol/Lα－丙氨酸（pH7.4）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）； ⑶ 0.1mol/Lα－酮戊二酸（pH7.4）（转氨基反应的底物）； ⑷ 0.1mol/L谷氨酸（pH7.4）（纸层析的标准样品）； ⑸ 展层溶剂－酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（300：1）（纸层析用）； ⑹ 10％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）； ⑺ 0.25%碘乙酸（抑制L－谷氨酸脱氢酶活性）； ⑻ 显色剂（0.1%茚三酮-乙醇溶液）。 ;四、实验器材与仪器 ⑴ 研钵； ⑵ 试管及试管架； ⑶ 恒温水浴箱（37℃、100℃）； ⑷ 铅笔、尺和圆规； ⑸ 毛细管（直径0.5mm)； ⑹ 新华定性滤纸（直径11cm）； ⑺ 剪刀和镊子； ⑻ 电吹风； ⑼ 滴管； ⑽ 康氏皿； ⑾ 喷雾器； ⑿ 烘箱（80 ℃）。;五、实验操作方法和步骤 1、转氨酶液的制备 取新鲜牛蛙肝或猪肝约3g，剪碎用研钵将肝脏碾碎，加3ml磷酸缓冲液迅速碾磨，加9ml磷酸缓冲液，用两层纱布过滤，收集浆液或滤液即得转氨酶提取液备用。 2、氨基移换反应 取4支洁净、干燥的试管，按表1操作;;;⑵ 点样：用毛细管依次点标准α－丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各点2次，其余1－4号管样液各点2～3次。点样时，要待前次点样干燥（可用电吹风吹干）后方可再次点样，点样直径不超过0.3cm。;;⑶ 展层、显色 将下端剪成须状,卷成的“灯芯”，然后将上端插入层析滤纸圆心处的小孔中, 平放在盛有展层溶剂的康氏皿中,使“灯芯”下端须状浸入展层溶剂中,再在滤纸上盖上另一康氏皿（图1）。展层剂沿灯心上升到滤纸,再向四周扩散,待溶剂前沿距康氏皿外槽内缘0.5cm(约需半小时)，取出滤纸，用镊子拔出灯心，滤纸用电吹风吹干，再用喷雾器向滤纸均匀喷洒0.1%茚三酮－乙醇溶液，用电吹风热风吹干或放入烘箱（80 ℃）中显色3min。;;谷氨酸;氨基酸样品的分离图谱;六、结果分析讨论 七、思考题 1.为什么要设计4支反应管？每管所要说明的问题是什么？ 2. 观察实验现象，并对层析后氨基酸的显色情况进行分析。 八、注意事项 1、避免污染滤纸，不要用手接触。 2、点样时，毛细管与滤纸轻微接触，不要留下痕迹。 3、实验报告附上层析滤纸。 ;下 次 实 验