目的基因的连接和转化.ppt

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2017-04-25 发布于北京
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目的基因的连接和转化

目的基因的连接、转化;分类及原理;DNA连接示意图;载体自连及去磷酸化;常用碱性磷酸酶;本实验连接材料及连接体系;连接示意图;连接体系;1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。 2. 进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE???含有离子，可能影响连接反应。;感受态细胞的制备;转化原理;转化示意图;连接效率的计算;Thanks !