第07章节酶剖析法dun.pptVIP

第七章 酶分析法;第一节 酶分析法的基本知识;蛋白质属性的酶是高效、高度专一的生物催化剂，它和生命活动密切相关。因此，酶学在生产实践基础理论研究方面，都起着非常重要的作用。 酶分析法则是其中的重要内容，也是目前发展较为迅速的一个领域。;酶的选择性及其在低浓度下能催化底物反应的能力，对化学分析有很大的用处。酶的催化反应早已用于底物、激活剂、抑制剂以及酶本身的测定。 在19世纪中叶已采用酶法来测定糖类。 20世纪40年代初，Warburg提出基于使辅酶还原而用光度法来测量NAD和NADP的方法。 必威体育精装版的发展是电化学法与荧光法的应用。酶分析法已成为一项公认的分析技术。 ;1.1 酶分析法的两种类型 一种是以酶作为分析对象，根据需要对样品进行酶含量或活力的测定，通常称为“酶活力测定”。 另一种是以酶作为分析试剂，用以测定样品中用一般化学方法难于检测的物质，如酶的底物、抑制剂、活化剂和辅因子等，一般称为“酶法分析”。 两者检测的对象虽有所不同，但原理和方法都是以酶能专一而高效地催化化学反应为基础，通过酶反应速度的测定来检测相应物质的含量。并且都需要选择适宜的反应条件和测定方法。 ;1.2 酶分析法的特征 ①选择性高。原则上讲，一种酶只催化一种反应，或者说只能催化某种特定的化合物或对特定的化学键起作用。这是由酶本身的高度专一性作用的特点所决定的。 ②灵敏度高。一般可测到10-7mol/L。如果与荧光法联用，可高达10-9mol/L左右。 ③反应速度快，条件温和。大多数酶促反应在30分钟以内可以完成。反应条件很温和，如在常温、常压和pH近中性的条件下，反应速度很快。;④酶用量甚微，所以比较经济。 ⑤精确度一般。主要源于微量吸管误差，如1ul以下的量，取样误差较大。同时也与组合方式有关。 ⑥适用范围有一定局限性。 只限于酶、底物、辅酶、活化剂或抑制剂的测定。 ⑦简便程度较差。必须具有酶学知识的操作训练，通常要求尽量减少人为误差，尽可能使所有反应体系条件一致。如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件(如温度、pH等)的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人，往往容易出错。;1.3 酶分析法的意义 酶的应用大致可分为四个方面： (1)用以制造某些产品； (2)用以去除某些物质； (3)用以识别某种化合物； (4)用以测定某种物质。 (1)和(2)应用最为广泛。例如用酶法生产可的松，用凝乳酶制造乳酪，用果胶酶澄清果汁等。 (3)和(4)属于酶分析法的范畴。;酶分析法迅速扩展 一个原因是由于酶工业的发展，可以方便获得各种酶制剂。 第二个原因提由于酶应用形式的发展。由于近十年来酶的固定化技术有了很快的发展，使酶的反复使用和连续使用成为可能。 固定化酶的品种已有不少，它们一方面和自动化测定技术相结合，促使酶自动化分析法的迅速普及。另一方面也正在进一步简便化，或制成含酶的试纸，或制成酶试剂包出售，一般只需要加一定量的水就可以直接使用。;酶分析法正在临床诊断、食品加工和发酵等方面广泛应用。 如用葡萄糖氧化酶(EC．1．1．3．4)测定血液葡萄糖是临床检验中常用的方法，而测定某些酶含量也是临床诊断的重要指标。;第二节 酶活力的测定;2.1 酶活力单位和反应初速度 2.1.1 酶量常用酶活力单位表示。 酶活力单位是指在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量。 酶含量则可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示(U/g或U/mL)。;①1959年国际生物化学协会酶委会接受了Racker等人的建议，采用了“国际单位”表示酶活力。 国际单位 IU：25℃，最适pH，最适底物浓度下，每分钟催化1μL底物反应的酶量。 当底物为蛋白质、多糖等包括多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键变化表示酶单位； 对于反应：A+B→C+D，可用两微摩尔A的变化计算酶单位。;②1972年酶委员会又提出一种新单位Katal。 在确定的最适反应条件下每秒钟催化 1摩尔底物变化所需要的酶量为1Kat。 1Kat=60×106IU。 ③在实际工作中,为了简便，人们往往采用各自习惯沿用的单位。有时甚至可直接用测得的物理量表示。如以光吸收的变化值(△A/△t)表示酶单位。;④在估计酶制剂纯度时则用比活力，即以单位重量的酶蛋白中酶的单位数 ⑤在酶高度纯净，且酶的分子量和每个酶分子上的活性中心数目已知时，可采用分子活力或转换率(TN)表示。 TN表示在最适条件下每个酶分子或每个活性中心每分钟催化底物分子(或相关基团)转化的