抗体检测的技术-类风湿因子.ppt

抗体检测技术;抗体检测技术 免疫酶技术 免疫荧光技术 凝集反应 沉淀反应 补体结合试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定 ;凝集反应;沉淀反应;双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。 ;; 酶联免疫吸附测定实验 (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay ;实验原理;方法类型;;;;一、试剂及仪器准备;⑵ 载体性能比较 要求：载体材料+、- 结果差别大 检测方法：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV10% ⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板 ;2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高 3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰 ;㈡ 酶结合物： 1. 要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定 2. 常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等 3. 底物： HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光 HRP不可溶性底物及呈色： DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚：灰蓝色 AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光 AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色 ?-半乳糖苷酶： 4-甲基伞基-?-半乳糖苷：荧光 ;4. 酶结合物的制备： 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法 ;（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪 指测读ELISA光度计；针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计 性能指标：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性 优良的酶标仪的读数一般可精确0.001，准确性为±1%，重复性达0.5% 操作：室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30min，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读;用途;WESTERN BLOT;;;;;;类风湿因子;类风湿因子;类风湿因子;类风湿因子;类风湿因子