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抗体检测的技术-类风湿因子
抗体检测技术;抗体检测技术
免疫酶技术
免疫荧光技术
凝集反应
沉淀反应
补体结合试验
放射免疫测定
蛋白印迹
免疫共沉淀
亲和力测定
;凝集反应;沉淀反应;双向扩散法的操作:生理盐水配制1%-5%的琼脂,取4mL倒在显微镜用的载玻片上,凝固后打孔,中心孔滴入抗原,外周孔滴入抗体用于测定抗体效价,中心孔滴入抗体,外周孔滴入抗原,用于检测抗原的存在和定性抗原。
;; 酶联免疫吸附测定实验 (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay ;实验原理;方法类型;;;;一、试剂及仪器准备;⑵ 载体性能比较
要求:载体材料+、- 结果差别大
检测方法:10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG,显色后,测20孔的OD,要求CV10%
⑶ 常用载体:
材料:聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等
形状:小试管、小珠、微量反应板
;2. Ag或Ab:纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab):
包被:将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液
封闭:包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被,以消除非特异吸附的干扰
;㈡ 酶结合物:
1. 要求:纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定
2. 常用酶:HRP、AP、?-半乳糖苷酶等
3. 底物:
HRP可溶性底物及呈色:
邻苯二胺(OPD):橙红(492nm);四甲基联苯胺(TMB):蓝色(450nm)
5-氨基水杨酸(5-ASA):棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2:荧光
HRP不可溶性底物及呈色:
DAB:棕黄色 α-萘酚:红色 3-氧基-9-乙基卡唑:红色 4-氯-1-萘酚:灰蓝色
AP可溶性底物及呈色:
对硝基苯磷酸酯(P-NPP):黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP):荧光
AP不可溶性底物及呈色:
NBT和BCIP混合液:紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液:红色
?-半乳糖苷酶:
4-甲基伞基-?-半乳糖苷:荧光
;4. 酶结合物的制备:
戊二醛交联法
过碘酸盐氧化法
;(三)设备:酶标比色仪简称酶标仪
指测读ELISA光度计;针对固相载体形式的不同,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计
性能指标:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性
优良的酶标仪的读数一般可精确0.001,准确性为±1%,重复性达0.5%
操作:室温宜在15-30℃,使用前先预热仪器15-30min,测读结果更稳定。测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读;用途;WESTERN BLOT;;;;;;类风湿因子;类风湿因子;类风湿因子;类风湿因子;类风湿因子
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