亲子鉴定DNA提取基准的操作规划.docVIP

广西区妇幼保健院司法鉴定所标DNA提取标准操作规程 文件编号： FYSJ1-SOP-04-2013 标题：DNA提取标准操作规程 版号： 第 1版 文件类型：受控 页码： 第  PAGE 6 页 共  NUMPAGES 6 页 DNA提取标准操作规程 1. 目的：规范不同检材的DNA提取操作程序，确保DNA质量，保证STR分型结果准确性。 2. 原理： Chelex-100 是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。 磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。 3. 操作者：具有法医物证检验资格的广西区妇幼司法鉴定所技术人员。 4. 标本：5％EDTA抗凝全血、8-10ml胎儿羊水、5％EDTA抗凝脐血、FTA纸血斑、口腔拭子、5-10根带毛囊的毛发、绒毛细胞。 5 试剂： 5.1 试剂的厂家及规格： 5.1.1 DNA抽提试剂 Chelex-100 伯乐公司（Bio-Rad Laboratories, Inc. CA U.S.A）。 5.1.2 DNA抽提试剂 Promega PP18或PP21 DNA System抽提试剂盒。 5.1.3 DNA抽提试剂 口腔棉签制备基因组DNA试剂盒（GT，U.S.A） 5.1.4 无水乙醇 分析纯 5.1.5 异丙醇 分析纯 5.1.6 无菌的超纯水由实验室技术人员制备。 5.2 试剂的配制： 5.2.1 5％Chelex-100的配制：称取5克粉状Chelex-100于试剂瓶中，加入灭过菌的超纯水至100ml。 5.2.2 灭菌超纯水的制备：用干净的试剂瓶装超纯水1升左右，经121℃灭菌30分。 6 仪器及设备： 6.1 生物安全柜。 6.2 高速离心机。 6.3 超速冷冻离心机。 6.4 移液器，单道微量移液器（0.5-10 ul单道）、单道微量移液器（10-100 ul单道）、单道微量移液器（100-1000 ul单道）、八道移液器（0.5-10 ul八道）和八道移液器（10-100 ul八道）。 6.5涡旋混匀器。 6.6半导体温控混匀器。 6.7超纯水制造系统。 7 操作程序： 7.1 全血或脐血的DNA抽提（Chelex-100法） 7.1.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。 7.1.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水980ul。 7.1.3核对血样，用移液器混匀，吸取1.5ul标本于EP 管中（-80℃存放超过一个月的血样取2-3.5ul）。 7.1.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。 7.1.5 加无菌超纯水980ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。 7.1.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。 7.1.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。 7.2羊水或绒毛A抽提（Chelex-100法） 7.2.1填写“PCR-STR基因扩增实验记录表”。 7.2.2 按照PCR-STR基因扩增实验记录表顺序标记1.5ml EP管，加无菌超纯水700?l。 7.2.3核对标本，用移液器混匀，吸取300?l于EP 管中。 7.2.4颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。 7.2.5 加无菌超纯水1000ul，颠倒混匀，12600rpm离心3.5min，弃上清，剩余沉淀约20ul。 7.2.6取混匀的5% Chelex-100溶液200 ul于EP管中（吸取时注意先摇匀5% Chelex-100），盖紧EP 管，振荡约15～20sec后， 56℃孵浴0.5～2h。 7.2.7 孵浴结束后振荡约15～20sec， 99℃孵浴8 min。 7.2.8 孵浴结束后趁热振荡约15～20sec，12600rpm离心3.5min，上清即为DNA溶液。 7.3 毛发的DNA抽提（Chelex-10