紫外分光光度计的使用原理及方法.pptVIP

?紫外分光光度计的使用原理和方法;紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS) ;紫外-可见分光光度法的特点： ;§1. 紫外-可见吸收光谱; 通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。如图3-1； 在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。 ;2 有机化合物的紫外-可见吸收光谱; 饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ* 跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。 ;生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。见表3-1和3-2。 ;红移和紫移 ;2.2 有机化合物的吸收带;3 无机化合物的紫外-可见吸收光谱;过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。 例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。;3. 电荷迁移光谱 某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。;1.4 影响紫外-可见吸收光谱的因素;2. 溶剂 注意如下几点： （1）尽量选用低极性溶剂； （2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性； （3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。 3. pH值;1.5 紫外-可见吸收光谱的应用 ;2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。 ;3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。 例如，某化合物??近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。;§2. 朗伯-比尔定律;吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即 A=lg1/T=lgI0/It ;二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。 ;三、吸光系数; 当l以cm，c以mol/L为单位，κ称为摩尔吸光系数，用 ε表示。