052986译文正文_样本.docVIP

┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 装 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 订 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 线 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 毕业设计（论文）报告纸 共  NUMPAGES 7 页 第  PAGE 7 页 Nature 2008 453: 223-229 REST参与mESC自我更新能力及发育多能性的维持 Sanjay K. Singh, Mohamedi N. Kagalwala , Jan Parker-Thornburg, HenryAdams Sadhan Majumder 摘要 受四环素调控的可诱导型RNAi的质粒表达系统是一种在哺乳动物细胞中用于基因功能研究的强大工具。但该系统并不适用于难转染的细胞系，如胚胎干细胞（特别是人的胚胎干细胞），某些原代细胞等。可诱导型的慢病毒载体的出现为这一问题的解决提供了可能。本实验中设计合成sox2 RNAi序列及egfp RNAi序列，退火后连接到pTER+载体上，然后再通过PCR的方法扩增出H1-TO-RNAi片段，最后将该片段连接到pLL3.7-H1载体上。利用三质粒系统的慢病毒包装平台，包装浓缩得到高滴度的病毒颗粒，然后分别感染tetR CGR8细胞和tetR SHhES1细胞。进一步，通过加四环素诱导RNAi序列表达，最后采用qPCR检测sox2 RNAi的效果。本实验以小鼠和人的胚胎干细胞为模型，试图建立一个慢病毒介导的可诱导型RNAi系统，为以后胚胎干细胞，特别是人胚胎干细胞有关基因的研究提供良好平台。 【关键词】sox2；慢病毒载体；RNA干扰；胚胎干细胞 在小鼠胚胎干细胞（mESC）中，神经抑制因子REST（RE1-silencing transcription factor;也叫做NRSF）呈现高水平的表达，但是它在mESC中所发挥的作用尚不清楚。我们发现，在mESC中REST通过抑制一种微小RNA（microRNA）——miR-21的功能，从而维持胚胎干细胞自我更新的能力及发育的多能性。我们发现神经抑制因子REST和那些已知的胚胎干细胞自我更新标志分子一样，在处于不断自我更新状态的mESC细胞中，其表达水平要远高于其在分化状态的mESC（小鼠拟胚体，mouse embryoid body，mEB）细胞中的表达水平。Rest杂合缺失（Rest+/-）的mESC及经短链干扰RNA介导（小干扰RNA）的REST表达下调的mESC自我更新能力部分丧失，即使这些细胞培养在有利于自我更新的条件下，也会导致多种不同细胞类型的特异性标记分子的表达。相反，当将外源的REST导入到mEB细胞中时，使得已经处于分化状态的吗mEB细胞的自我更新能力得到了维持。进一步实验显示，一方面培养在有利于自我更新的条件下Rest+/-的mESC中，包括Oct4(也叫Pou5f1), Nanog, Sox2和c-Myc在内的与mESC自我更新相关调控因子的表达明显下调；另一方面，在mEB细胞中外源表达REST可以使细胞维持自我更新表型及上述与mESC自我更新相关调控因子的表达。除此之外，我们还发现神经抑制因子REST可以结合到一系列的编码miRNA的染色体基因区域 ，而这些miRNA潜在的靶向上述与mESC自我更新相关调控因子。在正常的mESC和过表达REST的mEB细胞中上述miRNA表达水平很低，然而在mEB，Rest+/-的mESC细胞及经靶向REST的siRNA处理的mESC中，上述miRNA呈现高水平的表达。在这些可能受REST调控的miRNA中，至少miR-21能够通过下调Oct4, Nanog,Sox2及c-Myc等因子的表达特异性地抑制mESC细胞自我更新状态的维持。综上所述，我们可以认为REST是一种新发现的在mESC中维持自我更新和发育多能性的相互作用调控网络中发挥重要作用的因子。 REST被认为是神经发育过程中一个主要的转录抑制因子2-5，研究发现REST靶基因的激活足以促使神经干细胞或者神经前体细胞向各种类型的神经细胞转化6，7。然而，REST的生理作用却似乎因细胞而异，一方面REST有着致癌的作用8-10，另一方面，它又有一定的肿瘤抑制功能5，同时它又和造血系统及心脏的分化密切相关3-5。胚胎干细胞（ES cell）是一种有多分化潜能的细胞，它既能无限的进行自我更新，又能分化形出正常胚胎所具有的三个胚层来源的细胞11。本文中我们所提供证据显示出，在mESC中REST对其自我更新能力和多分化潜能性的维持发挥着独一无二的作用，而这种作用与胚胎干细胞中非常重要的调控因子（如：Oct4，Nanog，Sox2和c-Myc等）的表达是一致的。 我们首先对处于自我更新状态和分化状态的mESC（见图1a；mES 和mEB ）中RES