第3章外植体选择灭菌.pptVIP

复习题：;;第一节 外植体的选择 ;1 外植体部位;外植体选择的原则;2 取材季节 在生长开始的季节取材，若在生长末期或已进入休眠时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。 ;3 器官的生理状态和发育年龄;4 选取适宜的大小 材料太大易污染；材料太小，难于成活。 0.5cm--1.0cm。 如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小 ;第三章 外植体的选择和灭菌 ;1 外植体的灭菌方法 预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水中冲洗干净。 预处理的植物材料的灭菌： 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样;2 常用灭菌药剂的使用和效果;常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进70%的酒精中约30s。 ②用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min。 或用10%的漂白粉上清液中浸10min～ 15min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温） 或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。 ;1）表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。 2）与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。 3）若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。 4）HgCl2效果最好，但对实验材料的危害最大，要用水冲洗至少5次。 ;第三章 外植体的选择和灭菌 ;第三节　污染原因和预防措施 1、污染的原因 污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。;1.1 污染的原因：;1.2 细菌污染的特点： 菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即可发现。 原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%酒精精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。;1.3 真菌污染的特点： 污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能发现。 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。 ;污染后的措施;2 污染的防治措施; 2.1 防止材料带菌的措施 （1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行预培养。 枝条插入无糖的营养液或自来水，以新抽嫩枝条作为外植体； 或暗培养，待 抽出徒长的黄化枝条时采枝接种。; ; ;2.2 外植体的灭菌 （1）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌。 除去主脉、叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染； 消毒处理 次日再次消毒 对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，;（2）多种药液交替浸泡法;2.3 玻璃器皿的灭菌 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。;2.4 金属器械的灭菌 ;湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121 ℃的温度，灭菌20 min～30min。;2.6 无菌操作室的灭菌 ;2.7 操作人员在接种时一定要严格按照无菌操???的程序进行;防止操作带来的污染;B、接种过程中尽可能达到悬空要求;C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口;小结：常用的灭菌方法; 不耐热的物质的过滤灭(除)菌;小 结;复习 思 考 题