动物细胞培养的基本技术讲义.ppt

细胞培养基本技术;;消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant) 灭菌(sterilization) 防腐(antisepsis)和防腐剂 抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic) 无菌(asepsis) 无菌技术/无菌操作(antiseptic technique);【培养前准备】 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。;【操作野消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。;【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 ;【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 ;【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 ;培养细胞的观察;;细胞计数;细胞计数：　　1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。　　2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。　　3、静置3分钟。　　4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：　　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000　　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。;;根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹 打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。;贴壁生长细胞传代方法：;任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 ;1．台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； 用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力； 方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片； 4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。;2．四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值； MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。 ;操作步骤： 　　　（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％ CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养