wzc高级生化4-蛋白质的分离探析.ppt

第六节蛋白质的分离纯化和分析;一、蛋白质分离纯化的一般程序 ;3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。该法简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。;(二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等应根据性质而定。 如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（SDS、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。; 蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 性质 方法 分子大小 —— 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 溶解度 ——等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 电荷 ——电泳、离子交换层析 吸附性质 ——吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析） 特异性结合——亲和层析;蛋白质的分离纯化方法;蛋白质分离纯化方法;（三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离。主要根据蛋白溶解度的差异。 1. 等电点沉淀法 2. 盐析法 分步盐析分离不同蛋白质。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 如乙醇、丙酮等，它们的介电常数比水低，能降低球状蛋白质溶解度;有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。 有机溶剂会使蛋白质变性，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。;（四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。 常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。;纯化方法1.  凝胶过滤法 (Gel Filtration Chromatography，GFC);（1）葡聚糖凝胶; 葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒，在显微镜下放大700倍，可见其表面的网状皱纹。它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。 由于各种型号的葡聚糖凝的交联度(交联剂在葡聚糖凝胶中占的百分数)不同，致使其在水中的膨胀度(床体积)、吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀所需的水量。但不包括颗粒间所带的水量)、筛孔的大小和分级范围有明显的差异。 例如，Sephadex G—25比G—100交联度大。而影胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者。另外，前者对球形蛋白分级范围较窄。即在1000(下限)一5000(上限)之间，而后者范围较宽，即在4000—150000之间。;表 Sephadex1的种类与特性;Sephadex的稳定性 葡聚糖凝胶在水、盐、碱、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的，不溶解的，而且很少产生化学降解。在中性条件下，葡在0．1m01／L HCl溶液中浸泡1—2小时，甚至在0．02m01／L HCl溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 但是，当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。不然，微生物将生长。;吸附性： 葡聚糖凝胶系弱酸性物质。这是由于其每克干胶中含10—20微克当量的羧基基团所致。该基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质)发生吸附作用。但是，这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了。因此进行葡聚糖凝胶层析时，常用含有NaCL的缓冲液作洗脱液。 ; 新的葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响。 此外，葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集家具有较强的吸附作用，若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附原理，而不是排阻原理。 ;（2）琼脂糖疑胶;琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异 瑞典称Sepharose