常用分子生物学技术的原理及其应用教程.ppt

常用分子生物学技术的原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology;提 纲;第一节;5?;Cycle 3;PCR技术原理示意图 ; PCR的基本反应步骤;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+;利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 ;利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 ;将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。;逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前??组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 ;原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。;（三）实时PCR技术;实时PCR技术原理;实时PCR分类：;图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图;第二节;核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。;复性;（一）印迹技术;用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 ;二、印迹技术的类别及应用;其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip);三种印迹技术的比较;分子杂交实验;放射自显影照片;DNA芯片技术;第三节;基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) ;一、基因组DNA文库;基因组文库和cDNA文库的构建和筛选;第一轮筛选;cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 ;第四节;是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 ;基因芯片工作流程示意图;是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。;第五节;一、蛋白质相互作用研究技术;标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。;标签融合蛋白沉淀实验流程示意图;（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途;酵母双杂交系统的应用;电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。;;染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。;染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图