质粒提取和琼脂糖凝胶电泳.ppt

实验六 质粒提取及琼脂糖凝胶电泳;DNA重组：指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。 DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。;基因克隆简介 ;;分子生物学实验流程图;载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。 理想的质粒克隆载体应具有的特性： 能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增 具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS, multiple cloning sites)， 便于进行克隆;载体种类： 质粒 噬菌体载体 酵母人工染色体（YAC） 病毒载体 ;质粒 1.定义：质粒是独立存在于细菌染色体外的，能独立复制的环状双链DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。 ;2．来源 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 3．分类 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒 ①严紧型质粒(Stringent control) 严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 F 因子。 ②松弛型质粒(Relaxed control) 松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col质粒。 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。;4.质粒的构型 （1）. 超螺旋DNA （supercoiled DNA, sc DNA）;（2）.开环DNA (open circle DNA, oc DNA);（3）.线形DNA（linear circle DNA，lc DNA);与本实验有关的两种质粒;2.PUC18(作为载体）;实验 质粒DNA提取; 实验目的 1.掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。 2.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。;碱裂解法提取质粒原理 碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的分子大小和结构不同利用二者之间变性和复性的差异来实现分离的。;强碱及机械剪切力;琼脂糖凝胶电泳;带电颗粒在电场中泳动的速度;式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即 式中 f——阻力，牛顿； r——粒子半径，米； η ——介质粘度，牛顿·秒/米2；;从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比 ;电泳迁移率 电泳迁移率（mobility）:在电位强度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。;实验步骤; 琼脂糖凝胶板的制备 （封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳） ;主要试剂及作用;2.solutionII： ① SDS的作用裂解细胞和蛋白质变性作用 ② NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） 0.2mol/L NaOH 1%SDS 临用前新鲜配制. ;3.solutionIII： ①HAC溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使质粒DNA复性。 ②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。;4. 氯仿：进一步沉淀去除蛋白质 5. 无水乙醇：沉淀质粒DNA 6. 70%乙醇：洗涤质粒DNA 7. 上样缓冲液（6x）： ;便于观察DNA片段的位置;质粒三种构型电泳时泳动速度大小？ 超螺旋DNA线形DNA开环DNA;;Elements