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流式细胞术---理论及应用;主要内容;附二院分析型流式细胞仪;流式细胞仪基本构造;流式细胞术:用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。;流式细胞术光信号类型;散射光信号 FSC和 SSC 当颗粒通过聚焦光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称侧向角散射光信号（SSC）。 ;FSC：反应细胞大小和活力;SSC：反应细胞内部颗粒度和精细结构变化 ;FSC/SSC的作用;荧光信号;荧光通道;FL的作用;荧光素分子;荧光抗体的选择 根据流式细胞仪选择抗体 根据抗原表达强弱合理选择抗体 不同荧光素强度有所不同 高表达的抗原可不用太“亮”的荧光染料， “亮”的荧光染料分配给表达低的抗原 选择荧光波谱见光谱重叠小的染料进行组合，同时正确的调节补偿(细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测。由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠.) ;对照的设置;单标对照;流式数据显示: 单参数直方图 ( Histogram ) 双参数数据显示 -- 散点图(Dot Plot) --等高线图(Contour Plot) --密度图（Density Plot） 三维图 (3D Plot);直方图 ( Histogram ): 横坐标是散射光或荧光相对强弱，纵坐标代表细胞数;散点图： 每一个点代表一个细胞，横纵轴各代表一个参数;等高线图 ： 同一条线上的细胞数目相等，越靠里的曲线说明细胞数目越多 密度图：点密度越大的地方，细胞数越多;三维图;;流式细胞术应用----细胞周期;细胞周期：细胞从一次分裂完成到下一次细胞分裂结束所经历的全过程，分为间期和分裂期两个阶段;周期检测的原理;周期检测步骤;样本来源培养的细胞、血液、骨髓、体液、组织等的单细胞都可用于DNA分析；标本数应大于106注意获得单个细胞，尽量避免DNA降解；样本关键减少碎片（无EDTA/不可过度吹打/离心）；PI 既能和DNA结合，又能跟RNA结合，所以要用RNase降解脱氧核糖核酸酶会降解DNA,故耗材试剂要干净灭菌 。;流式细胞术应用----细胞凋亡;细胞凋亡概念;细胞凋亡多事件发生; 早期：AnnexinV（PS外翻） 早中期：JC-1( 线粒体膜电位) 中晚期：caspase-3、8、9（western） 晚期： TUNEL （ DNA 片段）;早期凋亡特征： 磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此 PI染色为阴性 DNA没有发生断裂;对照设置： 空白对照：不加AnnexinV/PI,用以调节电压，阴阳性细胞界限 单阳对照：诱导凋亡，AnnexinV/ PI单染，用来补偿 双染阴性对照：未诱导的 AnnexinV+PI双染。用它确定两荧光通道电压，排除非特异性结合 注意： 细胞制备或存储时细胞膜损伤，造成假阳性 贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子 当样本表达GFP时，禁用AnnexinV-FITC 推荐使用AnnexinV-APC/7-AAD染色;JC-1(BIC2)检测线粒体膜电位变化;Caspase-3检测 ;TUNEL检测;一步法 FITC-dUTP染色凋亡细胞 流式细胞仪488nm激发，PI发出623nm荧光，FITC发出520nm 荧光 ;TUNEL检测;;流式的其他应用;流式细胞仪预约使用规范;CytoFlex预约使用规范 ;谢谢！！