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流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用教程
流式细胞术
Flow Cytometry;什么是流式细胞仪;
1. 发展历史
1934 Moldavan
1973 Steinkamp
;2. 定义:对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光标记的细胞、粒子进行分析和分选的技术.
3. 特点
测量速度快,每秒钟能测数千个乃至上万个细胞
可进行多参数测量
在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来,即分选技术。
;
凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。
前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发
在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。
;二、流式细胞仪的工作原理和基本结构;;基本结构;三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数;血液涂片;外周全血细胞散射光双参数点图;荧光信号;荧光信号与细胞特性;二色镜
1 2 3;三 数据处理及流式报告;流式报告的图一般分为四种,即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。
几个概念:
%Gated:阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。
Mean:平均荧光强度,与被检测物质的表达量有关,在正态分布时一般用该值。
Geo Mean:几何平均荧光强度,在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。;散点图 ;图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死;流式细胞仪数据分析;流式细胞仪数据分析;图中100~101(M1)为阴性细胞,101以上的(M2)为阳性细胞 ; 五、 流式细胞术的应用;一) 细胞DNA含量检测;;单参数直方图;DNA细胞周期分析;2倍体;含量与凋亡关系;二)肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究
;1. 肿瘤诊断;2倍体;2. 凋亡研究;Annexin V Assay;图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死;Date acquired: 14-Jan-03
File: 7Gy 4hr.001
Source: dongbo
DIPLOID: 100.00 %
Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16
Dip G2-M: 9.59 % at 96.33
Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00
Dip %CV: 6.04
Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 ;根据凋亡细胞的特点来检测;
CD3(T细胞,CD4、CD8))、CD19(B细胞)、CD16、CD56(NK细胞),原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。
;;;流式细胞术检测细胞表型 ;
流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标???的单克隆抗体作分子探针,多参数分析白血病细胞的免疫表型,了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。
FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、准确,重复性好,能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等,对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。
; 五) 细胞内蛋白的分析:;荧光信号;荧光样本制备; 端粒(荧光蛋白);
六)细胞内钙离子测定
1×106/ml的细胞悬液,
加入终浓度为1-5μmol/ml Fluo-3/AM,充分混匀,室温避光作用60分钟。
以HEPES缓冲的Hank’s平衡盐溶液洗三次,重悬于0.5ml同样的溶液,上流式细胞仪检测。
根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。;FCM检测胞内钙离子、
膜电位和线粒体功能
;M1阴性界限划分完全是根据阴性对照!如下图:红色部分代表阴性对照,即:所检测的物质在阴性组中的基础表达量,可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组,也就是接受刺激后,功能状态下、药物作用后等。; 六. 分选:;488 nm laser;对比-----流式细胞仪是一种特殊的显微镜;流式细胞仪;谢
谢
大
家
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