3.酶的分离纯化.ppt

§1.6酶的分离纯化;提 纲;一、蛋白质纯化的一般考虑 ;※遵循的原则;※以酶的提出为例; 材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白;（一）材料的选择和细胞抽提液的制备;细胞破碎方法;破碎方法的选择;◆细胞抽提液的制备;提取举例;;（二）蛋白质的浓缩和脱盐;多孔板;（三）沉淀法分级蛋白;盐析法;盐析法的优点: 操作简便,使用范围广; 中性盐对易变性的蛋白质有一定的保护作用; 能同时除去较多的蛋白质,有纯化作用; 有浓缩蛋白溶液的作用 缺点: 分辨能力差,纯化倍数低。 ;有机溶剂沉淀法;有机聚合沉淀法;◆热变性 ◆ pH变性 ◆有机溶剂变性 氯仿变性血红蛋白是常用的有机溶剂变性的实例，将细胞匀浆液与乙醇-氯仿一起振荡，则可使血红蛋白沉淀变性;大规模？ ◆蛋白质的来源及释放 ◆分离和浓缩 ◆大规模层析技术 ;◆蛋白质的来源及释放;◆分离和浓缩;★双水相体系萃取法: 适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯化目的酶，它不仅可以克服离心和过滤中的限制因素，而且使酶与多糖、核酸等可溶性杂质分离，具有一定的纯化效果。 ※双水相的形成：将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合 时，当聚合物浓度达到一定值时，体系自然分成互不相 容的两相，形成双水相。 产生分离的推动力：聚合物水溶液的疏水性差异 常用的双水相体系：PEG/葡聚糖(dextran)；PEG/磷酸盐 ※萃取原理：利用生物物质在双水相体系中的选择性分配。 影响分配的因素: ①双水相体系的性质;②要分离物质的 性质;③离子性质;④环境因素 ;※优点：a.处理量大，750L双水相处理1000Kg细菌细胞糊 b.所需设备简单； c.操作方便、快速、条件温和，收率可达80%-90% d.不要求特殊处理就和于后续提纯步骤相衔接 ※发展: 到目前为止,用此法研究过的酶达50多种.近10年, Kula等开发了某些酶的双水相体系分离流程,成功 地从微生物碎片中提取纯化甲酸脱氢酶等一系列的 酶,处理量达50 Kg湿细胞,150Kg酶蛋白,收的率在 90%以上. 是生物化工中极有开发前途的蛋白质或酶的分离纯化技术 将疏水基团、离子交换基团、活性染料等引入聚合物上加强蛋白质或酶在某一相中的分配，是抽提更有效，各具特异性. 如将汽巴克隆蓝固定在PEG上，只经两步抽提，就将酵母磷酸果糖激酶提纯58倍。;★浓缩技术:;◆大规模层析技术;1.离子交换层析;★常用的层析柱有:CM-纤维素、DEAE-Sephadex ※例如，从胡萝卜软腐欧文菌中纯化天冬酰胺，若用CM- 纤维素分批吸附、洗脱，可是样品纯化6倍，体积减少 99%。 ※缺点：床体积容易被压缩，随pH的变化，床体积也变。 ★新的交换柱：将离子交换基引入到交联琼脂糖（如Sepharose Fast Flow）或大孔合成凝胶上。 ※优点：离子交换材料既坚硬，吸附容量又大；其颗粒 为小球形，既能保持高流速又具有高的分辨力，适用 于大规模层析。;2.凝胶层析;接有辛基和苯基的琼脂糖是最常用的疏水吸附剂。 特点：吸附容量大，适用于纯化的任何阶段，尤其适合于离子交换和盐沉淀之后；还有清除DNA和 热原的作用，适用于生产人用药物。 原理：蛋白质分子表面有部分疏水性区域，若在一极性很强的环境中，则会被吸附在非极性的固定化相载体上；若环境的极性降低，则可被溶离出来，即为疏水性层析法（HIC）, ??作用力为非极性基团间的疏水性引力。 与离子交换层析相比，虽然选择性较低，但不同类型的疏水吸附剂之间存在选择性。;;;3.亲和层析;;4.高效液相层析（HPLC）; 已开发出以克量级纯化蛋白质的HPLC技术。唯一的例子是用三嗪染料亲和纯化乳酸脱氢酶，每次层析可处理1.8g蛋白质，得到97mg均一的酶，收的率46%，耗时1h。 由于HPLC的柱体积可以加大，仪器操作自动化，可以在同一柱上反复负载样品，所以大规模制备的潜力很大。Waters公司已有用于大规模制备的层析柱。;The end !;第一章复习题