5-离心技术-09242016.ppt

第五章离 心 技 术; 离心技术：是利用旋转运动产生的离心力,根据物质的沉降系数或浮力密度的差别进行物质的分析、分离、浓缩和提纯的一种技术。 ;;1、离心力和相对离心力 离心力(centrifugal force，F) 指悬浮颗粒在离心过程中所受的离开旋转中心轴的作用力，由下式计算： ;2 、沉降系数(sedimentation coefficient, S); S 的数值受颗粒的相对分子质量和形状等特性的影响。;3、沉降速度（sedimentation velocity, v）;4 、沉降时间（t）和相对分子质量（Mr）;;preparative ultracentrifuge; a 水平转头 b 角式转头 c 垂直转头;学生实验中常用的是普通离心机（转速一般不高于4000rpm），用于分离血清和沉淀细胞、大的沉淀物等。;玻璃离心管;选用离心管时应考虑的因素： 容量：由样品的体积决定。高速离心时离心管必装满 形状：收集沉淀用圆锥形管底的离心管较好；而进行密度梯度离心时圆底离心管更有用 最大离心力：标准的玻璃管仅用于低速离心（小于2000g） 耐腐蚀性：详细信息可参考厂家的说明书 灭菌：一次性塑料离心管出厂时通常是消过毒的。玻璃管及聚丙烯管可重复灭菌使用。 透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管为半透明 能否刺穿：以刺穿法收集样品，纤维素乙酸管和聚丙烯管适合 管帽：大多数角式及垂直管式转子要求离心管有管帽，用以防止使用过程中样品漏出并在离心过程中支撑离心管;使用前在无负荷的情况下，开动离心机以便检查其转动是否平稳；检查套管内是否有橡皮软垫。 检查合格后,将用天平平衡好的装有样品的离心管放入离心套管内，位置要对称。 盖上离心机盖子，调零，接通电源,缓慢加速到所需速度。 离心完毕，待转速缓慢逐步调回零位，任其自动停稳后，方可打开盖子取出离心管，切勿用手助停。 离心过程中如发现声音不正常，机身不稳，应立即切断电源，待检查排除故障后方能使用。 ; 制备离心技术：是以分离纯化生化物质、细胞、亚细胞粒子为目的离心技术。 ;;密度梯度离心原理;密度梯度离心法应用;Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）的实验方法;4. 用毛细血???插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短管中，加入５倍以上体积的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。 用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上