ELISA【免检】.ppt

ELISA 知识简介;1.　ELISA的原理 2.　ELISA的类型 3.　试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4.　对照设定 5.　标本的采取和保存 6.　结果判断 ; ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。;酶免疫测定类型 ;1.1　抗原抗体反应 ;1.1.2　特异性 ;1.1.3　最适比例 ;1.1.4　敏感性;1.4　免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。;2　ELISA的类型;2.2.1　双抗体夹心法测抗原;2.2.2 双抗原夹心法测抗体;2.2.3 间接法测抗体 ;酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA夹心法测定抗原 ELISA间接法测定抗体 ;原理及意义 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的新型免疫检测技术。 将已知抗原或抗体吸附在固相载体微孔聚苯乙烯塑料板上，通过抗原抗体特异性结合吸附待测样品中的抗体或抗原后，加酶标抗体（酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原免疫反应的特异性，又不影响酶本身的活性）和底物后，在相应酶底物的作用下生成有色物质，其颜色深浅与标记物中相应的抗体或抗原的含量呈正比，由此可测定抗原或抗体的含量。 常用的ELISA法有双抗体夹心法测定抗原和间接法测定抗体。;ELISA法双抗体夹心法测定抗原 1.原理 ;常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。 一步法 将图中的第2步和第3步同时进行，允许混合加入，其形成的免疫复合物，基本不影响目测的结果，适用于目测结果。 二步法 如图中第2步和第3步由于分步进行，其结果较准确，主要用于需要定量检测时。;2.材料（以测HBsAg为例） 试剂：HBsAg诊断试剂盒 器材：酶联仪，微量加样器，吸头等 ;3.方法 加样：每组7微孔，待检4孔，空白对照1孔，阴、阳性对照各1孔。分别加阴、阳性对照1滴和50ul待测样本于相应孔内，置37℃水浴箱温育30分钟。 加酶：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板，置37℃水浴箱温育30分钟。 洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。 显色：每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃水浴15分钟，肉眼观察。 终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。;4.结果测定 用酶标仪（450nm）测定各孔吸光度OD值（先用空白孔校零）， P/N值≥2.1者判为HBsAg阳性，﹤2.1者判为阴性。;ELISA法间接法测定抗体 1.原理;2.材料（以测结核抗体为例） 试剂：结核抗体诊断试剂盒 器材：酶联仪，微量加样器，吸头等;3.方法 包被抗原：在聚苯乙烯微量反应板孔中加抗原100μl，4℃ 12－18小时。 用1％BSA或正常兔血清4℃、12－18小时阻断，4℃冰箱备用。 洗涤：用前应进行漂洗去除杂蛋白，用洗涤液洗3次，每次3分钟。 加待测样本：将血清稀释成1：50，每份标本加复孔，每孔100μl，37℃保温30分钟。设已知的阳性和阴性血清对照。 洗涤3次后，加兔抗IgG酶结合物，37℃保温30分钟，以相同的方法洗涤3次。 加新鲜配制的邻苯二胺底物溶液和双氧水溶液各100μl。静止20分钟，再加入3mol/L硫酸每孔50μl终止反应。; 4.结果测定 肉眼观察：白色背景上观察四孔呈现的颜色反应，与已知阳性和阴性孔比较。 酶联仪比色：酶联仪用492nm测OD值。正常人血清OD﹤0.39，结核患者≥0.4。正常人存在着结核抗体，一般为0.2－0.39。儿童卡介苗接种和隐性结核菌感染时可﹥0.4，但患结核病结核抗体OD值≥0.6，为轻度升高。;2.2.4 竞争法测抗体 ;2.2.5 竞争法测抗原;2.2.6 捕获包被法测抗体;2.2.7 ABS-ELISA法 ;3. ELISA的试剂(A、B、C三部分);ELISA的试剂准备A ;3.1.2 　包被的方式;不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。 亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法