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全基因组表达谱分析方法（DGE）----基于新一代测序技术的 技术路线 该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的TAG片段（特异性标记该基因）；然后通过高通量测序，得到大量的TAG序列，不同的TAG序列 的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到TAG代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。技术路线如下： 1、 样品准备： a) 提供浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8~2.2的总RNA样品； 2、 样品制备（见图1-1）： a) 类似SAGE技术，通过特异性酶切的方法从每个mRNA的3’末端得到一段21bp的特异性片段，用来标记该基因，称为TAG； b) 在TAG片段两端连接上用于测序的接头引物； 3、 上机测序： a) 通过高通量测序每个样品可以得到至少250万条TAG序列； 4、 基本信息分析： a) 对原始数据进行基本处理，得到高质量的TAG序列； b) 通过统计每个TAG序列的数量，得到该TAG标记的基因的表达量； c) 对TAG进行注释，建立TAG和基因的对应关系； d) 基因在正义链和反义链上表达量间的关系； e) 其它统计分析； 5、 高级信息分析： a) 基因在样品间差异表达分析； b) 库容量饱和度分析； c) 其它分析； 测序优势 利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，具体如下： 1．数字化信号：直接测定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。 2．可重复性高：不同批次的表达谱度量准确，能够更准确的进行表达差异分析。 3．高灵敏度：对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；能够检测出低丰度的表达基因。 4．全基因组分析，高性价比：由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。 5．高通量测序：已有数据表明，当测序通量达到200万个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300万~600万个表达标签。 6．无需重复实验。 7．可同时发现新的转录本、基因组表达调控区域等。 8．完整深入的生物信息学分析支持，更有助于进行重要的科学发现，发高质量的文章。 表达谱案例分析 肺癌组织的表达谱分析：选取2个肺癌病人（5T和10T）的组织提取总RNA，进行分析。 实验目的：为了检测两个病人中表达差异较大的基因，以便找出两个病人症状差异的原因，并进行下一步相关的研究。 1、 数据质量的概述 通过严格的质量标准筛选后，通过率达到80%，最终得到500万左右的Tag标签。 2、 标签的初步分析统计 两个样品中有95%的Tag重复频度超过1，73%以上的Tag重复频度超过50。 3、 表达谱测序饱和度分析 通过对表达谱测序饱和度的分析，通常在表达谱Tag数目达到200万时，测序Tag接近饱和。因此，通过Solexa测序，仅需要1次试验，就可以得到足够后续进行表达分析的数据。 4、 样品重复性。 5、 Tag标签的注释（含cDNA，预测基因，EST，线粒体基因组，基因组等） 本案例中，人的2万7千个基因中有50~60%都被Tag所覆盖。即一般的基因的表达量差异被检测出来。为了提高Tag同基因关联的可信度，我们仅仅选取了在基因序列中唯一定位的Tag。这部分唯一定位的Tag占全部Tag数目的50%左右。 另外，除去上述用于基因表达量统计的??一定位Tag，有大约20%的Tag被定位到了基因组的未注释区域，其中大约有10万个Tag在基因组上的位置是唯 一的。利用这些数据我们找到了许多新的转录本和调控区域。同时发现了若干潜在的两个样品间显著差异的区域。为后续的实验提供了可靠的研究目标。 6、 参考Tag标签的统计分析 下表显示的人的参考Tag的统计信息，我们可以看到96.53%的基因都拥有Tag。说明Tag-based 新一代测序技术的方法进行表达谱分析的可行性 7、 基因表达量的分布统计 8、 样本间表达差异基因的相关分析 通过对表达差异基因的统计和分析，我们可以选取样品间表达存在差异的基因，反馈给用户；此外一些已经报道可能相关的基因，是这一部分研究的重点，通过表达差异，我们可以推测出相关基因可能发生的变化。针对此例，图3-3中2个基因是已经报道的在10T样品中高表达的基因。 9、 样本间表达差异基因的信号通路相关分析 对差异表达基因进行功能分析和信号通路分析。结合样本性状差异，鉴定与性状关联的候选基因，以便通过进一步实验验证。 10、 根据Tag距离3’端的位置对tag和基因数目进