生化实验B教程.doc

合肥工业大学（宣城校区）化工与食品加工系·2015 PAGE27 / NUMPAGES27 《生物化学实验B》实验讲义 实验名称及学时安排 编号实验名称学时1蛋白质的沉淀和变性反应42氨基酸的分离和鉴定—双向层析法43总糖和还原性糖的测定—3,5二硝基水杨酸法44*不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法45*SDS法测定蛋白质分子量46*DNA的琼脂糖电泳4*实验1-3是食品科学与工程和化学工程与工艺专业的共有实验；实验4-6为食品科学与工程专业的专有实验。 2014-2015（二）生物化学实验B课表 生物化学实验课表（14级食品1-5班）周次节次星期一星期二星期三星期四星期五星期六星期日第5周1-41食品1班　　　　　5-81食品4班7-91食品3班1食品2班7-91食品5班第6周1-4　　5-82食品5班7-92食品1班2食品2班7-92食品3班7-92食品4班　第7周1-4　3食品1班4食品2班　5-8　3食品2班3食品5班7-93食品4班3食品3班4食品1班第8周1-4　　5-84食品4班7-94食品3班4食品5班　第9周1-4　5食品3班　5-8　5食品1班5-95食品4班5-9　第10周1-45-85食品2班5-95食品5班5-9第11周1-46食品3班5-86食品1班6食品4班第12周1-4　　5-8　6食品2班6食品5班　 实验一 蛋白质沉淀和变性实验 一、实验目的 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。 4. 了解蛋白质两性性质。 二、实验原理 在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型： 1．可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。 2. 不可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、试剂和器材 1. 试剂 （1）蛋白质溶液 取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配置。 （2）蛋白质氯化钠溶液 取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。 （3）蛋白质沉淀试剂 硫酸铵粉末，饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。 2. 器材 试管，过滤漏斗，试管架，玻璃棒，沸水浴，量筒，烧杯，试剂瓶，移液管，滤纸，洗瓶，废液缸，药匙，移液管架。 四、实验步骤 1. 蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用(分级盐析) 2. 蛋白质的不可逆沉淀反应 （1）重金属沉淀蛋白质 水 3-4滴0.5%乙酸铅 1ml蛋白质溶液观察沉淀观察沉淀是否溶解 （2）酸沉淀蛋白质 水 数滴5%磺基水杨酸 1）磺基水杨酸对蛋白质的沉淀作用 0.5ml蛋白质溶液观察蛋白质沉淀观察现象 摇动试管 10滴浓硫酸 2）浓硫酸对蛋白质的沉淀作用 6滴蛋白质溶液观察两液界面观察现象 （3）加热沉