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第三代测序技术简介   如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA 聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会 认为他异想天开，没有一点生物的sense 。  我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了！这个就是被称为第三代的 测序技术，Pacific Biosciences 公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing” （单分子实时DNA 测序）。  我有幸在NIH 听到了这个技术发明人Stephen Turner 博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录 整理一下。  要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。  第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子” 。但 是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入 DNA 链的时候，它的 荧光就同时能在DNA 链上探测到。当它与DNA 链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA 聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响 DNA 聚合酶的活性，并且在 荧光被切除之后，合成的DNA 链和天然的DNA 链完全一样。  第二个是纳米微孔。因为在显微镜实时记录 DNA 链上的荧光的时候，DNA 链周围的众多的 荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探 测成为不可能。Pacific  Biosciences 公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero‐mode  waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA 聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA 链周 围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A ，T ，C，G 这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常 快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标 记的脱氧核苷酸被掺入到 DNA 链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化 学键形成，荧光基团被DNA 聚合酶切除为止（见图）。    第三个是共聚焦显微镜实时地快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录。由于我 对显微原理的物理知识匮乏，而Pacific Biosciences 公司又没有非常强调在这方面的发明，不 做进一步探讨。  他们还对这一技术进行进一步的优化。  第一个是把双链 DNA 环化反复测序。人们可以在双链 DNA 的两头连上发夹结构的 DNA  adaptor，从而使DNA 环化。而 DNA 聚合酶就能够以环化的DNA 作为模板滚环复制，反复 测一段DNA 序列。这种反复测序，纠正了偶尔出现的复制错误，从而使测序精度非常高。 第二个是激发光中断测序法。DNA 聚合酶虽然很稳定，但是在强大的激发光作用下酶也是 有一定寿命的。如果把激发光中断一段时间，在这段时间内DNA 聚合酶继续复制DNA，当 激发光重新开启以后，人们就可以测到长DNA 链后面的序列。  第三代测序技术非常可怕。1、它实现了 DNA 聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测 10 个碱基，测序速度是化学法测序的2 万倍。2、它实现了DNA 聚合酶内在自身的processivity （延续性，也就是DNA 聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的 重复序列的拼接提供了非常好的条件。3、它的精度非常高，达到99.9999% 。  此外，它还有两个应用是二代测序所不具备的。  第一个是直接测RNA 的序列。既然DNA 聚合酶能够实时观测，那么以RNA 为模板复制DNA 的逆转录酶也同样可以。RNA 的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。  第二个是直接测甲基化的DNA 序列。实际上DNA 聚合酶复制A 、T 、C、G 的速度是不一样 的。正常的C 或者甲基化的C 为模板，DNA 聚合酶停顿的时间不同。根据这个不同的时间， 可以判断模板的C 是否甲基化。  Pacific Biosciences 公司预计2010 年或者2011 年就会推出商业化的测序仪器。在不远的将来， 如果他们能和二代测序一样集成100 万个纳米微孔，那么一台仪器15 分钟就能够准确地测 出一个人的基因组。以后每个人的基因组测序成本将变成100 美元，人人都可以消费得起。 想想人类基因组计划耗资30 亿美元，费时十几年，无数科