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T-Vector pMD19 （Simple） Code No. 3271 实验例 运输温度：-20℃ 包 装 量：1 μg 1. 在微量离心管中配制如下反应液（总体积为5 μl）。 保存温度：-20℃ T-Vector pMD19 (Simple) 1 μl *自收到之日起，适当条件下保存，两年内有效。 PCR产物或Control Insert 1 μl (0.1 - 0.3 pmol)* dH2O 3 μl 2. 向以上的DNA溶液中加入等体积（5 μl）DNA Ligation Kit 制品说明 Mighty Mix (Code No. 6023)，充分混匀。 T-Vector pMD19 (Simple)是两侧的 3 ’端添加了“T ”的线性化 3. 16℃反应30分钟。 载体，因大部分耐热性 DNA 聚合酶进行 PCR反应时都有在 PCR 产 注：（1） 5 分钟也能正常进行连接反应，但连接效率稍微降低。 （2） 长片段 PCR 产物（2 kb 以上）进行 DNA 克隆时，连接 物的 3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高 反应时间请延长至数小时。 PCR 产物的连接、克隆效率。本载体尽管消除了 LacZ 基因上的多 4. 全量（10 μl）加入至100 μl E.coli 感受态细胞中，轻柔混合 克隆酶切位点，但不影响β-半乳糖苷酶的正常表达，因此，PCR 然后冰中放置 30 分钟。 产物克隆后仍可以利用 α-互补性进行蓝白菌落的筛选，挑选阳性 5. 42℃水浴 45 秒钟后，迅速转入冰中放置 1 分钟。 克隆。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的 PCR 产物将 6. 加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7. 取 100 μl 转化液涂在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板 无法使用载体上的限制酶切下，需要在 PCR 扩增引物上导入合适的 培养基上，37℃过夜培养。 酶切位点。本制品中的 Control Insert （500 bp）还可以用于Control 8. 挑选白色菌落，PCR 验证。 反应。 *Control Insert 为500 bp 的3’末端带有A 碱基的 PCR产物， Control Insert 1 μl （50 ng）的摩尔数约为0.15 pmol。在进行 制品内容 克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为 1：2-10。 T-Vector pMD19