南京大学 分子生物学 课件 第16讲.ppt

三、阻遏蛋白与操作子的相互作用 （一）操作子上与阻遏蛋白结合的位点 1，lacI基因的表达特点 2，lac操作子（lacO）与阻遏蛋白的结合 （1）阻遏蛋白与lacO结合的实验证据;（2）lacO与阻遏蛋白结合的位点及其结构 A，DNA内切核酸酶消化实验证明：受阻遏蛋白保护区域位于-5 ~ +21(26bp) B，阻遏蛋白保护位点 C，lacO 的结构及其与阻遏蛋白的结合性质;;3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的影响 （1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合 （2）阻遏蛋白与DNA的结合能增强RNA聚合酶结合启动子的能力（RNA聚合酶与的平衡常数从1.9*107增加到2.5*109）;（3）阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶与lac启动子上形成一个很强的关闭式的转录起始复合物，阻止转录的起始 （4）阻遏蛋白的这种作用对操纵元的诱导也有促进意 4，上述模式不一定适用于其他系;（二）阻遏蛋白上与操作子结合的位点 1，阻遏蛋白单体的结构 （1）长头片段（long headpiece） （2）短头片段 （3）核心片段（core） （4）铰链区;2，阻遏蛋白四聚体的结构 3，阻遏蛋白与操作子的结合 4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完全的阻遏作用 （1） lac系统存在多个操作子 （2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操作子结合 （3）阻遏蛋白结合第二个操作子影响阻遏的水平;（三）阻遏蛋白与操作子的解离 1，诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接结合的证据 2，诱导物与阻遏蛋白的结合 3，阻遏蛋白与不同DNA的结合 （1）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结合的特异性 （2）细胞内阻遏蛋白的结合位点 （3）细胞内阻遏蛋白的存在;（四）影响阻遏蛋白与操作子相互作用的突变体 1，i-突变体 2，iS突变体 3，it突变体 4，i-d突变体 等位基因互补 5，Oc突变体;第四节 分解代谢产物抑制涉及的启动子正调控;最常见的是大肠杆菌对碳源利用有关的一组操纵元，受一种代谢产物激活蛋白（catabolite activator protein，CAP）控制，在葡萄糖存在时保证细菌优先利用葡萄糖;2，分解代谢产物抑制 含义：葡萄糖会引起许多操纵元（包括乳糖操纵元、半乳糖操纵元和阿拉伯糖操纵元）表达的阻遏 原因：葡萄糖引起cAMP含量下降，使分解代谢产物激活蛋白失活，从而抑制依赖该蛋白的利用其他碳源的代谢相关酶的表达;二、CAP对启动子的正调控 1，cAMP在分解代谢产物抑制中的作用 葡萄糖引起cAMP水平下降是分解代谢产物抑制的原因 cAMP由腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，cya）合成 cya基因突变体对葡萄糖变化没有反应;2，CAP的作用 （1）CAP的结构特征 CAP是同源二聚体，由两个22.5KD的亚基构成 CAP单体含DNA结合区及转录激活区;（2）CAP结合的DNA位点 CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的序列 阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸序列中（TGTGA），该序列可能是识别的必需成分;CAP与有两个（相反的）五核苷酸序列的位点结合最强，因为这样两个单体均可结合DNA;相对于RNA聚合酶的结合位点，CAP可以与不同的DNA位点结合;（3）CAP的激活 只有当cAMP存在时，CAP才具有活性;（4）CAP对转录的激活作用 A，CAP激活转录的途径 直接与RNA聚合酶作用 作用于DNA，以某种方式改变其结构以利于RNA聚合酶的结合;B，CAP与DNA和RNA聚合酶的作用 CAP二聚体结构保证了一个亚基可与RNA聚合酶接触，哪一个亚基以何种方向与DNA结合无关紧要;C，CAP对RNA聚合酶的作用取决于两者的相对位置： CAP位于启动子内部（如gal）时，可提高闭合复合物向开放复合物的转化速率 当CAP位于启动子临近位置（如lac）时，其主要作用是提高最初结合的速率，以形成开放复合物;第四节 操纵元的其他调控形式;2，代谢步骤 （1）半乳糖+ATP 半乳糖1-磷酸+ADP+H （2）半乳糖1-磷酸+UDPGlu UDPGal+葡萄糖1-磷酸 （3） UDPGal UDPGlu 总反应：半乳糖+ATP 葡萄糖1-磷酸+ADP+H ;（二）gal操纵元 1，gal操纵元组成 （1）结构基因（galK，galT，galE） （2）调节基因（galR） 与结构基因相距很远 诱导物：半乳糖 galR－突变：造成组成型表达 （3）P/O位点 galOC突变：造成组成型表达 ;2， gal操纵元的启动子（图8－9） （1）gal P1 转录起始位置：S1（+1） 转录依赖cAMP-CAP 功能：葡萄糖不存在时负责gal操纵元的转录 （2）gal P2 转录起始位置：S2（-5