抗肿瘤药物实验法是.ppt

抗肿瘤药物实验法; 在抗肿瘤研究中，人们提出了肿瘤多步骤、DNA突变、细胞凋亡、细胞周期核心机制、细胞周期启动及多条信号转导途径参与等许多理论和学说。 抗肿瘤药的研究随着理论的更新和技术的进步，已从以核酸等为靶点的杀伤型细胞毒药转向对肿瘤新靶点的研究。包括化学预防药、分化诱导剂、凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、肿瘤耐药逆转剂、生物调节剂以及化放疗保护剂等。 随着新型抗癌药的研究，诞生了许多抗肿瘤药物实验方法。;第1节 肿瘤细胞体外筛选方法; 1.MTT法 【基本原理】活细胞线粒体中存在的脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色的甲臜；而死细胞此酶消失，MTT不被还原。 用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光度（OD值）。 OD值与活细胞数成正比，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。 ;【操作步骤】 （1）0.25%胰酶消化对数生长期细胞，5%～10%NBS的RPMI 1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂对照，每组3-6平行孔。37℃，5%CO2、95%空气的培养箱中预培养24h，弃上清。 （2）加药物5个10倍稀释的浓度（溶剂常用的有二甲亚砜和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （3）细胞连续培养24～72h，每孔加入10μl 5mg/ml的MTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。 （4）吸去上清。加入200μl DMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。 （5）计算抑制率(%)=（对照OD-药物OD）/对照OD*100%; 2.XTT法 【基本原理】XTT 是MTT的衍生物，经过活细胞代谢还原成水溶性的代谢产物，代谢产物的量与活细胞的数目成正比，因此利用酶标仪在检测波长465nm处测定代谢物的OD值可以推测活细胞的数量。数据处理方法同MTT法。 ;【操作步骤】 （1）细胞接种，药物处理均同MTT方法。 （2）药物处理24～72h后，每孔加50μl XTT溶液（内含50μg XTT，5μl 10mmol/L的电子偶联剂 (PMS)）继续培养4h。 （3）96孔培养板振荡2～3min后，直接用酶标仪在465nm波长处测OD值。 ;【注意事项】 （1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去上清就可测OD值，简单方便，减少误差。 （2）XTT不易被线粒体酶还原，因此同时加入电子偶联剂 (PMS)。 （3）每孔的XTT量不宜加入太多，高浓度的代谢产物抑制线粒体酶活性。 （4）XTT和PMS现用现配。 ;3.染料排斥法检测药物对肿瘤细胞的生长抑制 【基本原理】 活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等染色的能力，而细胞死亡后由于膜完整性遭到破坏，细胞即被着色。 ;【操作步骤】 （1）25ml培养瓶中加入细胞4×104个、受试药40μl，终体积4ml， （2）5%CO2，37℃培养48～96h。 （3）取细胞悬液0.4ml，加0.4%台盼蓝液0.1ml，在室温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细胞中死细胞（蓝色）的个数。 【结果评定】 （1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）×100%。 （2）将活细胞率与药物浓度的对数作图，可得到S形剂量反应曲线，计算半数杀伤浓度（LC50）。 （3）当LC5010μg/ml并能重复时，提示药物应进一步实验。 ;【注意事项】 药物杀伤细胞作用可能被低估原因： （1）存活细胞可能继续繁殖，使活细胞率增高。 （2）死细胞可能过早地崩解，计数时已不存在，使死细胞率下降。 ; 4.集落形成法测定药物对肿瘤克隆原细胞的生长抑制作用 【基本原理】克隆原细胞指具有持续增殖能力的细胞。当单个细胞能连续分裂6代或以上时，其后代所组成的群体（集落）含50个以上细胞。计数集落可以对克隆原细胞作定量分析。反映了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗肿瘤药物的活性，目前被认为是一种较理想的检测方法。 常用的集落形成方法可分为贴壁法及半固体培养基法。 ;【操作步骤】 （1）贴壁集落形成：适用于几乎所有贴壁生长的细胞。 1）生长期贴壁细胞一瓶，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，活细胞计数，培养基稀释成50～100个细胞/ml。 2）取直径33～35mm培养皿（或15ml培养瓶）或6孔板，每组3复孔/皿，受试药20μl，稀释后细胞悬液2ml，摇匀，5%CO2、37℃培养箱培养7～14天。 3）弃上清，PBS洗2次，2ml/次，无水甲醇固定5min，静置干燥，用吉姆萨染色或1%结晶紫染色5～10min后，用自来水