第三章载体2006是.ppt

第三章 基因工程载体;在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。;表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数;2. 载体的功能 （Vectors）;Characteristics of vectors for gene cloning; （1）具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性), 且在宿主细胞内能独立复制。 （2）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 （3）具有较高的外源DNA的装载能力 （4）具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点(即多克隆位点) 。;4. 载体的组成部分 — 基因工程对它的要求; 基因工程中常用的载体有5类： ;第一节 质粒载体 ;大肠杆菌的质粒;质粒的特点;二、质粒（plasmid）的命名 ;如：pSC101 ;（1）分子小： ;（2）编码基因少： ;（4）质粒的空间构型：;③ 线形DNA （ linear ，lDNA）;（5）质粒空间构型与电泳速率;四、质粒的类型;除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。;大肠杆菌接合（conjunction）;2. 非接合型质粒：;;带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。;五、质粒的复制类型;六、质粒的不亲和性;质粒不亲和性的分子基础： 主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 一般认为质粒的不亲和性由定位在质粒上的inc基因决定的。inc基因指令宿主细胞合成一种阻遏物，调节内源质粒复制。成熟的细胞中，内源质粒都处于相对稳定的饱和状态。因此，亲缘密切的质粒由于受同一阻遏物的制约，即使被引入细胞内也不再复制，就自行消失。 另一种解释认为质粒复制必须同细胞质膜结合，各种质粒有各自的结合位点，而亲缘密切的质粒有相同的结合位点，当其中一种质粒已占满结合位点后，亲缘密切的另一种质粒即使进入细胞内已无立足之地，也就自行消失。因此，如果含有一种pMU派生质粒的寄主细胞被另一种pMBl派生质粒所转化，那么选择出的含有第二种质粒的细胞，往往也就失去了第一种质粒。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.; 当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，就得考虑受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属于亲和性质粒。 作为受体的细胞最好不含内源质粒。 ;七、显性质粒和隐蔽质粒; 至今发现的显性质粒——抗菌素的抗性质粒（R质粒）、产大肠杆菌素（colicins）的Col质粒、引起细胞接合的育性质粒（F质粒）、降解金属有机物、芳香烃和农药等毒物的降解质粒和致植物形成冠瘿瘤的Ti质粒等。 不同R质粒分别含有对氨苄青霉素（Ap或Amp）、氯霉素（Cm或Cmp）、卡那霉素（Km或Kan）、四环素（Tc或Tet）和链霉素（Sm）等药物的抗性基因。 一般一种R质粒只含一种药物的抗性基因，但是有的R质粒可含有2种或更多种药物的抗性基因。例如发现R222质粒含有对Sm、Cm和Tc等药物的多种抗性基因。 蓝藻内源质粒属于隐蔽质粒。 ;质粒赋予寄主的功能： 赋予寄主细菌额外的特性：抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，以及其它方面的特征等。其中对抗菌素的抗性是质粒的最重要的编码特性之一。 质粒DNA编码的基因：有产生抗菌素的基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒素基因、重金属抗性基因、产生细菌素的基因、诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因，以及寄主控制的限制与修饰系统的基因等数十余种。 ;（1） 具有复制起点（ORI）;（3）若干限制性内切酶的单一位点;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;;氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）; 常用抗菌素的抗性工作原理;ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）;a）杀菌原理;iv）链霉素（Streptomycin，Str）;v）四环素（Tetracycline，Tet）;;;② 遗传标记;;当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;4. 人工构建的质粒载体