细菌内毒素检测方法介绍是.ppt

细菌内毒素检测方法介绍;内 容;一、概念及相关知识;1942年，美国药典首次收载热原检查法，中国药典自第一版（1953年版）起收载。 所有注射用药品（肌肉注射、静脉注射）都要经过热原检查。 热原检查法的局限性： 1、重现性差。 2、对药物引起的增加、抑制作用无法控制。 3、不同细菌产生的热原质的致热域有差别。 4、非定量反应。 虽然不排除有其他热原物质存在，但细菌内毒素是最主要的热原物质。;细胞壁结构： 肽聚糖 脂蛋白 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 外膜 磷壁酸 脂多糖 细菌内毒素：革兰氏阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖（LPS）。当细胞壁外膜结构完整时不具备生物活性，只有当细菌死亡，脂多糖脱落才显示出内毒素活性。 脂多糖结构：多糖O抗原＋核心多糖＋类脂A;内毒素???量值： 1、内毒素单位（EU） 1982年FDA将当时美国代号为EC－2的内毒素标准品规定为5EU/ng。1983年内毒素单位（EU）被USP正式引用。 2、国际单位（IU） WHO先后两次组织协作标定，建立内毒素国际标准品，其中第二批内毒素国际标准品适用于所有内毒素检查法，且明确1IU＝1EU。;鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。 鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;鲎试剂与内毒素反应机理;细菌内毒素检查法;二、细菌内毒素检测之凝胶法;实验材料及用具 1、仪器 ;试剂 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、三效热原灭火剂 5、75％乙醇 常用英文缩写 BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水 MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照 MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照 λ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值;灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。 试验举例：内毒素工作标准品为100EU/支； 待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：;0.2ml;2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支，按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管（10mm×75mm），将试管按如下形状排列。 3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。;反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持完整为“－”。 当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ： λc＝lg-1(∑X/4) （X:反应终点浓度的对数值。） 当0. 5λ≤λc ≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度λ为准。;举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml:;样品内毒素检查 1、供试品最大有效稀释倍数的计算： C·L MVD＝ λ λ：测试用鲎试剂灵敏度标示值(EU/ml)。 L：供试品细菌内毒素限值。 C：供试品浓度或供试品复溶后所得样品浓度。 当L单位为EU/ml（溶液）时，C的单位为1ml/ml； 当L单位为EU/mg或者EU/u时（抗生素原料），C的单位为mg/ml或者u/ml。;2、供试品溶液稀释：将供试品稀释，稀释倍数为MVD。 含2λ内毒素