荧光法测定药片中维生素B是2含量.ppt

荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量;荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量;实验原理;实验原理;a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。;激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。;发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。;荧光分析仪器;荧光分析仪器;a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。 b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。 c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。; 维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。; 维生素B2溶液在430～480 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 ;光黄素;实验预习;F-4500型荧光光度计（日本日立公司） 10mL具赛试管10只，移液枪1只， 100 mL容量瓶2只 5×10-5g·mL-1 VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR）， 药用VB2试样(5×10-4g·mL-1 );1.打开计算机，先接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下Xe? LAMP按钮，再接通主开关（MAIN），此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作软件。 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上???择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。 3. 样品测定。 4. 关机顺序：逆开机顺序实施操作。;1. 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： 在10个干净的10 mL具赛试管中，分别吸取25、50、75，100、125、150、175、200uL VB2标准溶液，用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。;2. 未知试样的测定: 在两支10 mL具赛试管中，分别移取100 uL试样, 用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。;1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。 2. 根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中VB2含量。;1. 解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。 2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？;1、?波长扫描（Wavelength? Scan）? 对样品进行激发波长或发射波长的扫描。 点击快捷栏“Method”,显示出“Analysis Method”的五个命令，分别为 General(常规)、Instrument(仪器条件)、Monitor(模拟监测)、processing(处理方法)、Report(报告格式)，输入相应数据。;1.1? General Measurement-----选择Wavelength 1.2 Instrument Scan?? mode------输入扫描方式 Data?? mode------输入数据采集方式 EM??? WL------输入发射波长 EX? Start? WL------输入激发起始波长 EX?? End? WL------输入激发终止波长 EX?? WL------输入激发波长??? EM? Start? WL------输入发射起始波长 EM? End? WL------输入发射终止波长;Scan? speed------扫描速度选择 Delay------延迟时间 EX? Slit------激发单元狭缝 EM? Slit------发射单元狭缝 PMT? Voltage------光电管负高压 Response----