蛋白质及氨基酸的测定是.ppt

生物技术第三组; 蛋白质存在于一切生物的原生质中，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生命的物质基础。凡是有生命的物体，无论是动植物还是微生物，都还有蛋白质。蛋白质与营养代谢、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转和遗传等密切相关，缺乏蛋白质生物就不能维持生命。人及动物只能从食物中得到蛋白质 及其分解代谢产物来构成自身蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。;蛋白质是由多种氨基酸结合而成的复杂的高分子化合物。其中含有的主要化学元素为碳、氢、氧、氮等，大多数蛋白质还含有硫，某些蛋白质中还含有微量的磷、铜、铁、碘、锌等元素，但含氮则是蛋白质区分其他有机化合物的主要标志。;测定食物中蛋白质含量的方法有多种，一般可分为间接方法和直接方法。 间接方法是通过测定样品中蛋白质的总氮量???再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量 直接方法是根据蛋白质的物理和化学性质，直接测定蛋白质含量的方法。 测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法。它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，应用广泛。此外，双缩脲法、紫外吸收法、考马斯亮蓝G-250法、福林-酚法等也常用于蛋白质含量测定。; 凯氏定氮法 双缩脲法 紫外分光光度法 福林-酚比色法 考马斯亮蓝染料比色法 ;由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定总有机氮最准确和操作简单的方法之一。 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量，由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物，因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。 ;;常量凯氏定氮法;A.样品消化 浓硫酸对含氮有机物的消化作用主要是氧化还原作用，使有机物碳化的同时在高温下又有强氧化性，能将有机物氧化分解成水和二氧化碳，使氮还原为氨，氨与硫酸作用生成硫酸铵留在溶液中。 B.蒸馏 在消化完全的样品中加入浓氢氧化钠溶液，加热蒸馏，生成气态氨。 C.吸收 用硼酸吸收蒸馏所放出的氨气。 D.滴定 标准盐酸或硫酸溶液滴定完全吸收后的溶液 ; 为了加速反应进行，我们常需加入一定量加速剂。按其效果不同可分为：增温剂、催化剂和氧化剂。 1.增温剂 当温度低于360°C时，消化不完全，尤其是杂环氮化物，会导致分析结果偏低。当温度高于410 °C时，铵盐就会分解，故消化温度最好控制在二者之间。 纯硫酸的沸点是340 °C附近，因其温度达不到最适，则需要添加增温剂，常用的增温剂有：硫酸钾，硫酸钠，主要原因是消化过程中硫酸不断被分解，水分不断逸出使硫酸浓度增大。 注意：加入量不能过大，温度过高会引起已生成的铵盐分解释放出氨而造成损失。;2.催化剂 其种类繁多，最常用的是硫酸铜。催化剂能降低反应所需的能量，除此之外硫酸铜还可指示消化终点的到达和下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。 3.氧化剂 由于氧化剂反应过于激烈，若使用不当易造成氮损失结果不稳定，常需严格控制它的用量和次数。 常用的有：高氯酸，过氧化氢;A、凯氏烧瓶;;1、浓硫酸 2、硫酸铜 3、硫酸钾 4、4%硼酸溶液 5、甲基红---溴甲酚绿混合指示剂： 五份0.2%溴甲酚绿、95%乙醇溶液、一份0.2%甲基红乙醇溶液均匀混合 6、40%NaOH溶液 7、0.1000mol/L盐酸标准溶液 ;测定;;;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;微量凯氏定氮法;;;注意事项;双缩脲法测定蛋白质含量;1、蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜作用产生颜色反应，生产紫红色化合物，称为双缩脲反应。 2、具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。 3、在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度;当脲被小心加热至150-160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲反应方程式如下： 双缩脲在碱性条件下与少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应;1.标准曲线的绘制 以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管中，然后各加上1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min，取离心后的透明液于比色皿中，在