dd神经干细胞的的分离培养及体外分化.pdf

·综　述· 神经干细胞的分离培养及体外分化 唐少锋 综述 　汤 　逊 　林月秋 审校 中图分类号 　R687 　　　文献标识码 　A 　　　文章编号 　1005 - 8478 (2003) 11 - 0777 - 04 作者单位 :成都军区昆明总医院骨科 ,云南 昆明　650032 作者简介 :唐少锋 (19712) ,男 ,安徽砀山县人 ,主治医师 ,硕士。研究 方向 :脊柱外科与脊髓损伤。电话 : (0871) 4074662 　E2mail : tshf200097 @hotmail. com 　　目前 ,脊髓损伤的修复和治疗 ,仍然是一个难以解决的世 界性难题。虽然在动物实验中已取得了一些令人鼓舞的进 展 ,但至今未找到一种能用于临床的有效方法。神经干细胞 (neural stem cells , NSCs) 的发现为中枢神经系统 (central ner2 vous system , CNS)损伤修复及某些疾病的治疗带来了新的希 望。因其具有很强的分裂、增殖和自我更新能力 ,人们把它视 为中枢神经系统移植和替代治疗的理想材料。近年来神经干 细胞的研究作为生命科学界的热点受到广泛关注。本文就神 经干细胞的分离、培养及其体外分化作一综述 ,重点在于人神 经干细胞的研究。 1 　啮齿动物神经干细胞 Reynolds等于 1992 年首次提出成年哺乳动物脑中存在干 细胞的可能性 1 ,他们将成年小鼠的纹状体在含有 EGF 的无 血清培养液中进行培养 ,发现部分细胞可分裂增殖形成悬浮 细胞团 ,并呈 nestin (一种神经上皮干细胞中间丝蛋白) 阳性 , 贴壁培养后生成神经元和星形胶质细胞。同时 Reynolds 用相 同的培养方式从孕 14d( E14)的胎鼠 (小鼠)纹状体分离到类似 的细胞 2 。值得注意的是 ,同年 Richards从成鼠海马也分离出 相似的多能干细胞 3 ,表明在 CNS 的其它区域也可能存在干 细胞。1994 年 Davis 从胚胎大鼠皮质分离到能产生 CNS 全部 三种细胞类型 (神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞) 的多 潜能干细胞 4 。1996 年 Gritti 5 等将成年小鼠的纹状体在含 有 bFGF 的无血清培养液中进行培养 ,也发现单个细胞可增殖 形成球形细胞团 ,将其移至去除 bFGF 的培养液中培养 ,能产 生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞 ,从而证明成年哺乳 类个体脑内存在干细胞。同年 Weiss 等运用与 Reynolds 相同 的方法从成年哺乳动物脊髓分离到干细胞 6 。2002 年 ,Lie 等 发现并证明了成年大鼠黑质中也存在干细胞 7 。迄今为止 , 在胎鼠的 CNS 大部分区域 ,包括皮层、室管膜下层、脊髓、海 马、中脑、小脑等处都已分离出神经干细胞 ,而在正常成年鼠 的纹状体、皮层和室管膜下层等区域也都证实了神经干细胞 的存在。 神经干细胞在分离培养过程中表现出很大的种属差异 性 ,类似的培养条件对从不同种属动物同一部位分离的细胞 具有不同的影响 ,甚至同一种属的不同种类也存在明显差异。 孕 16d( E16)的 SD 大鼠纹状体干细胞在 EGF 或 EGF 和 bFGF 存在的情况下仅能扩增 21～28d ,之后出现危象并死亡 ,而胚 胎小鼠纹状体干细胞能长期生存 8 ,有人报道其增殖超过 40 代 9 。Chow 等 10 的实验显示 ,分别从 SD 大鼠和 Fischer 344 大鼠的胎鼠脊髓分离的细胞在含有 EGF 和 bFGF 的培养基中 都能增殖传代 ,并具有分化为神经细胞和胶质细胞的能力。 但孕 14d( E14)的 Fischer 344 大鼠脊髓干细胞仅能维持 9 代 , 之后死亡 ,而孕 14d( E14)的 SD 大鼠脊髓干细胞可传到 20 余 代 ,而且晚代细胞继续表现为 nestin 阳性 ,并能对不同的外源 性因子反应性分化成多种表型。 2 　人神经干细胞 近年来人们对人神经干细胞 ( human neural stem cells , HNSCs)的分离、传代做了大量的研究工作 ,报道了许多细胞培 养方法 ,其不同点主要在于培养方式 (悬浮还是贴壁) 、细胞的 存活时间、扩增细胞的同质性或异质性、丝裂素的刺激方式和 细胞的分化特性的差异。从文献报道来看 ,人神经干细胞的 分离、培养及长期传代要比啮齿动物困难的多。在培养过程 中 ,人们发现其中一个主要的难点在于其长期增殖传代和干 细胞特性的维持。目前 ,体外获得人神经干细胞的途径主要 有三种 : (1)借助于永生化基因 ; (2)直接从人神经组织分离培 养 ; (3)从更原始的干细胞分化产生。第一种途径采用遗传修 饰法 (epigenetic and genetic metho