lisiman实验兜宁血清蛋白的盐析及清球比值测定.ppt

医学生物化学与分子生物学实验教程 ;实 验 二;掌握盐析的原理和方法。掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。了解血清蛋白质定量测定的临床意义。; (Experimental Principles) 蛋白质的胶体性质 蛋白质的呈色反应——考马斯亮兰染色法 ;盐析 ; 中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。; 蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。 沉淀的原因:破坏水化膜;改变蛋白质表面基团的解离。 沉淀的方法:盐析法;有机溶剂法;重金属盐沉淀法;生物碱试剂沉淀法；加热沉淀。 ;正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分约60%以上，其余为球蛋白，两者比例为1.5-2.5：1。兔血清清球比0.6-1.5：1。 清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。;蛋白质的呈色反应 考马斯亮蓝显色法 ;【仪器试剂】 血清、饱和硫酸铵溶液、标准蛋白溶液、 考马斯亮蓝G-250 722S型分光光度计； ;标准曲线的绘制及标准曲线法;1.标准曲线制作 （1）蛋白标准液的倍比稀释： ;（2）标准曲线的制作 ;【操 作 步 骤】 （Operating Procedure） （一） 血清蛋白的盐析 取1.5 ml EP管1支+0.5 ml血清——滴加饱和硫酸铵0.5 ml（血清已被稀释了2倍），边加边混匀——室温静置5分钟后，10000rpm，离心2分钟——转移上清至另一支EP管内备用，此为盐析上清。 ;(二).血清中蛋白质浓度的测定 （1）血清样品的稀释：取2支1.5 ml EP管， 标记1号、2号，按下表稀释.留2号管备用。 ;（2）盐析上清（清蛋白）的稀释：取2支1.5 ml EP管 标记3号、4号，按下表稀释 ;（3）血清中蛋白质浓度的测定：取2支大试管， 标记5号、6号，按下表加入试剂。 ;（三）绘制标准曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白 浓度及清/球比值。 血清蛋白（总蛋白）浓度 = 图示值×200（稀释倍数）= （mg/ml） 盐析上清（清蛋白）浓度 = 图示值×200（稀释倍数）= （mg/ml） 计算清/球比值: 清蛋白的浓度/（总蛋白的浓度-清蛋白的浓度） = ;思考题(Questions) 蛋白质分离纯化的方法？ 凯氏定氮法 双缩脲法(Biuret) 紫外吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford） Folin—酚试剂法 ; 血清蛋白质测定的临床意义; 肝脏的基本功能;1、血液生化检验（肝功检查） 肝脏的合成功能：总蛋白（TP）、清蛋白（ALB）、球蛋白（GLO） 肝细胞受损的情况：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST） 肝细胞的代谢功能：直接胆红素（DBIL）、总胆红素（TBIL） 2、病毒标记检测（乙肝五项）。 ;血清总蛋白和清蛋白、球蛋白比值测定;  血清总蛋白 （Serum total protein；TP）??? 静脉采血2ml，不抗凝，分离血清进行测定。??? 血清总蛋白包括白蛋白及球蛋白。 【正常参考值】  60～80 g/L　;【异常结果分析】 总蛋白增高：☆ 急性失水所致血液浓缩，如严重呕吐，腹泻，大量出汗。☆ 某些球蛋白增多疾病，如多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症等 总蛋白降低：☆ 病因基本同清蛋白降低; 清蛋白（Albumin；ALB）??? 静脉采血2ml,不抗凝，分离血清进行测定。??? 清蛋白几乎都由肝脏合成，它是血浆中的主要蛋白成分，具有结合，转运其他分子、维持血浆胶体渗透压等重要作用。 【正常参考值】 40 ～ 55 g/L ;【异常结果分析】 清蛋白降低： ☆肝细胞病变：慢性肝炎，肝硬化，肝坏死，肝癌，肝功能严 重受损等。 ☆蛋白丢失过多：肾病综合征，大面积烧伤，浆膜渗出性损害等 ☆蛋白摄入不足：如营养不良，慢性腹泻，吸收不良综合征等。 ☆慢性消耗性疾病：如恶性肿瘤，结核病，甲状腺功能亢进， 长期慢性发热等。; 清蛋白／球蛋白比值（A／G） ???