荧光定量PCR之绝对定量分析-标准曲线的绘制.doc

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荧光定量PCR之绝对定量分析-标准曲线的绘制

荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制 1. 绝对定量定义 绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。 将标准品稀释至不同浓度,作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线,对未知样品进行定量时,根据未知样品的CT值,即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。 * Log(起始浓度)与循环数呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 * 由样品CT值,就可以计算出样品中所含的模板量 2. 绝对定量标准品 标准品的一些标准 * 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增,并且扩增效率相同 * 标准品必须是经过准确定量的(我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计) * 标准品必须是标准化的(例如,同一化的细胞数) * 在每组实验时,必须用相同的阈值设定来确定CT值 标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA,也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物,当然也可以是基因组DNA,甚至cDNA,但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。 3. 标准品的制备 一般一条标准曲线取四到五个点,浓度范围要能覆盖样品的浓度区间,以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次,对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。 倍比梯度稀释方法: 1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液,得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液,得标准品iii 1v标准品iii+9v稀释缓冲液,得标准品iv 1v标准品iv+9v稀释缓冲液,得标准品v 依次倍比稀释 拷贝数的计算:详见核酸拷贝数的计算 4. 实例 标准品的制作:将标准品依次进行10倍稀释,ASP-3700 测得其拷贝数1.55×108copy /ul 标准曲线的绘制(1cycle=1min) 设置对照:浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个,设空白对照 PCR反应:以不同浓度标准品作为模板 标准品的扩增曲线 标准品的溶解曲线 标准品的标准曲线图 X Log  7  6  5  4  3  2  1 Y CT值 12.01 14.89 17.92  21.18 24.56 27.89 31.25 扩增效率(E)计算: E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04,E%=(2.04-1)×100%=104% 若未知样本的CT值为19.11,将CT值代入线性方程: 即19.11=34.29-3.23X,所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7 Quantityunknow=104.7=50118 copies 核酸拷贝数的计算 一、分步推理如何计算核酸拷贝数 1A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml 核酸浓度=(OD260)×(dilution factor)×[33或40或50]=ng/ul MW代表 克/摩尔,单位dolton:1dolton即表示1g/mol 1摩尔=6.02x1023摩尔分子(拷贝数) 平均分子量(MW):dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基) ssDNA = (碱基数)×(330道尔顿/碱基) ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基) 得到拷贝数计算公式:(6.02x1023拷贝数/摩尔)×(浓度)/(MW g/mol)= copies/ml. 即(6.02x1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml. 或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul. 例:3000碱基质粒,浓度100 ng/ul MW=3000bp×660dalton/bp=1.98×106daltons,即1mol=1.98×106g (100ng×10-9)g/1.98×106=摩尔数 copy数=摩尔数×6.02×1023=3×1010copies/ul. 二、这是一个小小的计算器,使你计算更加方便快捷,免去算数之???……  H

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