双缩脲法测定的血清总蛋白的方法学评价.doc

 PAGE \* MERGEFORMAT 9 双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价 摘要：目的 评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。方法 配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线性范围测定。结果 双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R2为0.9877。结论 双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高，本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有其他同学的结果比较好的。 关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价 双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一。《全国临床检验操作规程》推荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法[1]。方法???评价对于医学检验专业学生日后在工作中评价检验方法非常重要，对培养学生逻辑思维和实验室质量控制具有重要作用。本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对学生练习和掌握方法学评价有重要意义。 双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能在碱性环境中与二价铜离子结合生成紫红色络合物。此反应不需要加热，被用来定性鉴定蛋白质。但请注意：凡含有2个以上肽键的物质或含有1个肽键和1个一CS—NH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽[2]。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。 1. 仪器与试剂 1.1 仪器 721型分光光度计；水浴箱。 1.2 试剂 牛血清白蛋白；硫酸铜结晶(CuSO4?5H2O)；酒石酸钾钠(NaKC4H4O6?4H2O)；氢氧化钠(NaOH)；碘化钾(KI)；蒸馏水。 2. 双缩脲的配制 2.1 称取6g NaOH溶于新鲜制备的25 ml蒸馏水中，配成6mol/L氢氧化钠溶液。 称取0.75 g硫酸铜，2.25 g酒石酸钾钠，1.25 g碘化钾依次溶解于125 ml蒸馏水中．在搅拌下加人6mol/L氢氧化钠溶液25 ml，用蒸馏水定容至250 ml。配好的双缩脲试剂应贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存，若瓶中有黑色沉淀出现则衙重配。 2.2 通常加入碘化钾可以防止铜离子自动还原形成一价氧化铜沉淀。在配制双缩脲试剂过程中，进行两种不同加试剂顺序，如下 顺序1：硫酸铜→酒石酸钾钠→碘化钾→氢氧化钠 顺序2：硫酸铜→碘化钾→酒石酸钾钠→氢氧化钠 这两种顺序的区别是加酒石酸钾钠和加碘化钾的顺序不同，“顺序1”在加完酒石酸钾钠后溶液是青蓝色的(如图1左)，“顺序2”在加完碘化钾后溶液颜色是褐色的(如图1右)，但两种顺序在加完所有试剂后，颜色都是相同的，都为深蓝色，如图2。这两种不同加试剂顺序的配制方法，虽然过程不同，过程中颜色变化也不同，但最后的结果是相同的。 图1 (左为先加酒石酸钾钠) 图2 (左为先加酒石酸钾钠) 3. 批内重复性试验 3.1 材料 待测样品、双缩脲试剂、蒸馏水、721型分光光度计、水浴箱 3.2 方法 3.2.1 取21支试管放试管架，分别标记空白管1支，重复测定管20支，按表1添加试剂。 表1 试剂添加 加人物(ml)试剂空白管测定管×20蒸馏水0.06—待测样品—0.06双缩脲试剂333.2.2 涡旋混匀后，37℃水浴10分钟，在波长540nm条件下比色，空白管调零，用分光光度计测定各管吸光度。 3.2.3 计算待测样品的标准差S和变异系数CV%值。 3.3 结果 3.3.1 结果记录 表2 20个测定管的吸光度值 试管号吸光度试管号吸光度试管号吸光度试管号吸光度10.12160.12110.14160.1420.13170.123120.14