实验二 细菌的抹片的制备及染色.doc

PAGE  PAGE 8 实验二 细菌抹片的制备及染色 提前十分钟进入实验室，抄写板述。上课，点名入座。 板述内容： 一）、目的要求 1、掌握细菌抹片的制备方法 2、掌握细菌的革兰氏染色法 二）、实验内容 1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。 2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。 3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌） 4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教） 三）作业 1、叙述细菌抹片的制备方法 2、叙述革兰氏染色的方法 3、绘出细菌形态图并注明染色方法 总结上次实验作业，有两个突出问题。 多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。 有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。 实验第一部分：抹片的制备 实验的目的和意义 细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。 细菌抹片的制备 进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下： （1）玻片准备 载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有油渍，可按下列方法处理： A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。 B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。 （2）抹片 所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。 A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。 C、组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压积或涂抹成一薄片。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一张玻片上有秩序地排好，作多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留标本片，应贴标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 （3）干燥：上述涂片，应让其自然干燥。 （4）固定：有两类固定方法。 A、火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。 B、化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2-3分钟，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2~3分钟后，自然挥发干燥。抹片如作瑞特氏染色，则必先须作特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。 目的：将抹片固定的目的有如下几种： ①除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附玻片，以免水洗时易被冲掉 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力较强。 ③可能杀死抹片中的微生物。 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片时，应严格慎重处理染色用过残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即可进行各种方法的染色。 实验第二部分：染色 常应用各种染料对细菌进行染色，由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用，以及离子交换，酸碱等化学作用，染料就能使细菌着色，且因细菌细胞的结构和化学成分不同，而含有不同的染色反应。 常用的细菌染色方法，主要有两种类型： 1、简单染色法 只应用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。 2、复染色法 应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用。染色后不同的细菌和物体，或者细菌构造的不同部分可以呈现不同的颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆萨染色法。 1）美蓝染色法 在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖涂抹点即可）美蓝染色液，经1-3分钟，水洗，干燥（可用吸水纸吸干，或自然干燥，但不能烤干），镜检。 2）革兰氏染色法 A、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2分钟，水洗。 B、加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-2分钟，水洗。 C、加95%酒精于抹片上脱色，约0.5-1分钟，水洗。 D、加稀释石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染10-30秒，水