实验二细菌基的因组DNA的提取.ppt

细菌基因组DNA的提取;分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。;核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取时间。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 ;核酸制备的步骤： ;核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。;DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。;RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 ;核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核小体上的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。;核酸制备中常用的蛋白质变性剂 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。 ;核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶 ; ;细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 DNA提取 SDS（十二烷基硫酸钠 ）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。 ;核酸样品的保存 温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0;二、材料、设备及试剂 ;1、培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.2ml的培养物离心12000rpm,1min。 2、沉淀物加入570ul的无菌水（或TE）缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30ul 10%的SDS和10ul 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。 3、加入100ul 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，于60 ℃温育10min。(上下颠倒混匀)，离心，12000rpm,5min。 4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提两次） 5、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟，离心,12000rpm,10min 。 6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗涤，离心5min