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实验四:酵母的菌形态观察及计数
酵母菌形态观察及微生物直接计数法;酵母菌形态观察及微生物直接计数法;一、目的要求:
1、观察酵母菌的形态特征及出芽方式。
2、了解血球计数板计数原理,掌握显微
计数的原理及方法 。;二、实验原理:
1.酵母菌
酵母菌是单细胞真核生物,菌体比细菌大且不运动。繁殖方式以无性为(芽殖或裂殖)有性繁殖产生子囊和子囊孢子。
;2.酵母死活细胞鉴别的理论依据:
本实验通过美蓝染液水浸片观察酵母的形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性的染料,它的氧化型呈蓝色,还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时,由于细胞的新陈代谢作用,细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞 则呈蓝色或淡蓝色,借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。 ; 直接计数法是利用血球计数板在显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清。;4.血球计数板的构造;
血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图21-1),计数区的刻度有两种:一种是计数区分为16个大方格(大方格用三线隔开),而每个大方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个大方格(大方格之间用双线分开),而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即计数区都由400个小方格组成。 ;计数区边长为1mm,高度为0.1mm,所以每个计数区的体积为0.1mm3。
在计数时,通常数五个中方格的总菌数N,然后求得每个中方格的平均值,再乘上16或25,就得出一个大方格中的总菌数,然后再换算成1ml菌液中的总菌数,最后乘以稀释倍数M。
计算公式:
25个中方格
1ml菌液中的总数=N/5×25×10000×M=50000N×M(个)
16个中方格
1ml菌液中的总数=N/5×16×10000×M=32000N×M(个);5.计数原则
1.在计数前若发现菌液太浓或太稀,需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 5~10 个菌体为宜。
2.每个计数室选 5 个中格(可选 4 个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。
3.位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。
4.如遇酵母出芽,芽体大小达到母细胞的一半时,即作为两个菌体计数。
5.计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样 品的含菌量。 ;三、实验操作:;2.死活细胞鉴定美蓝浸片观察
(1)在载玻片中央加一滴0.1%美蓝染色
液,挑菌混匀;
(2)倾斜缓慢放置盖玻片;
(3)放置3min后镜检;
(4)染色半小时后再次进行观察,注意死
活细胞数量是否增加;
??(5) 用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 ;3.血球计数实验操作
(1)镜检计数室:去污,清洗,吹干;
(2)加样品:盖上盖玻片,菌悬液于边缘滴一小滴,渗入,使充满菌液;
(3)显微镜计数:加样后静止5min,每个小格内5-10个菌体,取5个中格(可选4个角和中央的一个中格)计数;
(4)清洗
(5)计算菌浓度;思考题:
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