实验2研究生PCR产物鉴定及PCR原理应用.ppt

生化与分子生物学技术;实验室秩序 （时间，物品保管，工作服，分组与值日） 仪器与设备的使用 实验室安全环保 ;实验二  apoB基因多态性分析--PCR产物电泳检测;? 电泳的概念;? 实验室中常用到的电泳方法 （以介质分类）;? 电泳的基本原理;琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小、构象及电荷数不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 ;1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 ;1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围;一、电泳前准备;二、制胶;三、上样电泳;　基因组DNA 　电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头， 　　微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X加样缓冲液 ：Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液; Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液;PCR-apoB基因多态性产物的鉴定;琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、1%胶3mm、凝固后拔梳）;;;PCR技术的创建;二、PCR技术的发明—Kary Mullis 1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上…… ;PCR从构想成为现实 1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。 ;;94℃变性;;Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus);72℃; 1988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化 1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年。 1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。 ;Kary B. Mullis（1944－）;PCR仪的变迁;;经典循环参数（500bp以内）;PCR技术的特点;;分子克隆（目的基因的获取和鉴定）;; 围绕二硫键构建不同结构的K5缺失突变体（PCR－缺失突变） ;2、临床基因诊断;遗传疾病的基因诊断 ;;;;DMD：人类肌营养不良基因;PCR-RFLP法：(PCR产物限制性酶切片断多态性分析);;正常;个体识别；亲子鉴定 方法：PCR-RFLP（限制片段长度多态性） DNA指纹 PCR-ASO （等位基因特异性寡核苷酸） PCR-VNTR（可变数目串联重复序列）多态性 PCR-STR（短串联重复序列）多态性 PCR-SSCP（单链构象多态性） 线粒体DNA测序;性别鉴定; PCR-STR(short tandem repeat)多态性检测;;;1：Marker 2：阳性模板 3：待测样品1 4：已确诊乙肝病人样品 5: 待测样品2 6: 待测样品3 7: 阳性模板; PCR-VNTR(Variable numble of tandemly repeated short DNA sequence) 多态性检测;3’VNTR位于该基因3’端下游第2个Poly A信号以下位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区（minisatellite）。 根据重复序列长度的不同，可分为不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种Apo B基因3’VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种等位基因，长度在400～1200 bp之间. 根据重复序列的内部结构分为两类：ATAATTAAATATTTT，称为X型；ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷酸取代（即G或C取代T）， 又可产生X或Y的变异体Xi、Yi、Xii和Yii等。 VNTR重复序列数目的不同，以及每一重复序列内部结构的变化决定了