SDS-PAGE蛋白凝胶电泳.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）;实验目的;实验流程;实 验 过 程;2.凝胶配制;实 验 过 程;加入分离胶溶液 pH 8.8;;1. SDS 2. ?- mercaptoethanol 3. bromophenol blue 4. Glycerol;实 验 过 程;;;电 流 路 径　　;实 验 过 程;蛋白质的染色方法;;实 验 原 理;实 验 原 理;Pr为什么带负电;实 验 原 理;实 验 原 理;;实 验 原 理;实 验 原 理;实 验 原 理;实 验 原 理;实 验 原 理;PageRuler Prestained Protein Ladder  A prestained SDSMW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa. ;注意事项;思考题;;Tanon-1600数码凝胶图像分析系统 GIS 1D 图像分析软件(Ver. 4.00);诱导前后蛋白表达差异;电泳过程中的不正常现象;2 皱眉现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当明胶和玻璃板组成的“三明治底部有气泡”或靠近隔片的凝胶聚合不完全 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 ;3 “拖尾”现象 ???品溶解不佳引起或分离胶浓度过大 ;4 “纹理”现象 样品中的不溶性颗粒引起的;5 偏斜现象 电极放置不平行或加样位置偏斜引起;6-2 整块胶分离的条带太宽 主要是未浓缩好的原因 处理办法： 适当增加浓缩胶的长度； 保证浓缩胶贮液的 pH 正确 （6.7） ； 适当降低电压； ;7. “鬼带” “鬼带”就是在跑大分子、构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性， WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法： 在加热煮沸后， 再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇， 以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。 ;谢谢!;附：蛋白质的提取与定量方法;提 取 原 则;哺乳类细胞的裂解液-RIPA;蛋白酶抑制剂;定量方法;以双缩脲为基础的方法;以双缩脲为基础的方法;Bradford法;;选择蛋白质定量方法时应考虑